JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:46 min • July 8th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo macrófagos derivados da medula óssea em lamínulas.
Trate os macrófagos com promastigotas de Leishmania - o estágio infeccioso do parasita.
Durante a incubação, os parasitas interagem com os macrófagos, facilitando a montagem da F-actina ao redor do local de interação.
Os macrófagos engolfam os parasitas em fagossomos cercados por F-actina, formando vacúolos parasitóforos ou PVs - um nicho replicativo.
Dentro dos PVs, os parasitas liberam fatores de sobrevivência, aumentando o acúmulo de F-actina ao redor dos vacúolos e inibindo sua fusão com os lisossomos.
Além disso, os parasitas regulam positivamente a produção de hepcidina - um hormônio peptídico de macrófagos, inibindo a liberação de ferro e elevando os níveis de ferro intracelular.
O influxo de ferro em vacúolos promove a diferenciação de promastigotas em amastigotas patogênicos e facilita sua multiplicação, aumentando a virulência.
Pós-incubação, lave para remover os parasitas livres e, em seguida, fixe e permeabilize os macrófagos infectados.
Introduza um corante fluorescente de ácido nucleico para corar os núcleos de macrófagos e amastigotas infectados.
Sob um microscópio de fluorescência, pequenos núcleos agrupados em torno do grande núcleo do macrófago confirmam a presença de parasitas intracelulares, demonstrando a virulência de Leishmania.
No sétimo ou oitavo dia após a cultura, use uma ponta de aspiração instalada em uma linha de vácuo para transferir quatro lamínulas de vidro de 12 milímetros esterilizadas em autoclave para o fundo de cada poço de uma placa de cultura de seis poços sem sobreposição. Prepare placas idênticas para cada ponto de tempo do experimento. Em seguida, lave as culturas de macrófagos derivados da medula óssea 2 vezes com PBS fresco a 37 graus Celsius e cinco mililitros de PBS sem cálcio e magnésio, suplementado com um EDTA milimolar em cada placa.
Após cinco minutos a 37 graus Celsius, agrupe as células destacadas em um tubo cônico de 50 mililitros, enxaguando cada placa duas vezes com mais cinco mililitros de PBS sem cálcio e magnésio. Após centrifugação, ressuspender os macrófagos em cinco a 10 ml de meio macrófago fresco derivado da medula óssea em gelo. Após a contagem, dilua as células para uma concentração de 5 x10,5 por mililitro em meio macrófago fresco derivado da medula óssea e adicione dois mililitros de células por poço à placa de 6 poços. Em seguida, incube as células durante a noite na incubadora de cultura de células.
Para infectar as células com L amazonensis, diluir a suspensão do parasita para a multiplicidade experimental apropriada de infecção e adicionar 50 a 100 microlitros de parasitas a cada poço de todas as placas de seis poços, incluindo todos os pontos de tempo do experimento. Incubar os macrófagos derivados da medula óssea durante o período de infecção e a temperatura adequados.
Em seguida, lave os poços três vezes com dois mililitros de PBS fresco a 37 graus Celsius sem cálcio ou magnésio por poço e fixe as amostras iniciais com 1,5 a 2 ml de paraformaldeído a 2% por 10 minutos. Para as placas correspondentes aos pontos de tempo posteriores, adicione 2 mililitros de meio macrófago fresco derivado da medula óssea a cada poço e retorne as placas à incubadora apropriada. Em seguida, fixe e lave as células para cada ponto de tempo restante, conforme demonstrado, e armazene as amostras a 4 graus Celsius em PBS fresco.
Para corar as células com DAPI, substitua o sobrenadante por 1,5 ml de PBS fresco sem cálcio e magnésio, suplementado com detergente não iônico a 0,1% por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de três lavagens de 2 mililitros com PBS sem cálcio ou magnésio. Em seguida, core as células com dois microgramas por mililitro de DAPI em 1 mililitro de PBS por uma hora em temperatura ambiente. Após três lavagens, coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em lâminas de microscópio de vidro individuais montadas com um reagente de montagem antidesbotamento disponível comercialmente.
Em seguida, para quantificar o número de células infectadas, use a objetiva de óleo de imersão 100x de um microscópio de fluorescência e o contador Emanuel para identificar o número de núcleos amastigotas menores agrupados em torno de cada grande núcleo de macrófago corado com DAPI.