Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:30 min. • July 8th, 2025
Sob um estereomicroscópio, observe organoides gástricos, estruturas celulares tridimensionais compostas por células gástricas diferenciadas e células-tronco.
Introduzir um microinjetor carregado com Helicobacter pylori, um patógeno gástrico.
Insira a agulha no organoide alvo e injete a suspensão bacteriana.
Observe uma solução turva se desenvolver dentro do lúmen.
H.pylori emprega uma proteína adesina específica em sua superfície para se ligar ao receptor da célula gástrica, estabelecendo uma interação estável entre as bactérias e as células hospedeiras.
Essa interação desencadeia o alongamento da secreção bacteriana pilus, uma grande estrutura em forma de túnel que se estende em direção à membrana da célula hospedeira.
H.pylori usa a secreção pilus para injetar fatores de virulência, incluindo o gene A ou associado citotóxico na célula hospedeira.
Uma vez dentro da célula, o sofre fosforilação pela quinase da célula hospedeira.
O fosforilado desregula múltiplas cascatas de sinalização intracelular que alteram as funções da célula hospedeira, promovendo a transformação cancerígena.
Colete os organoides infectados para análise posterior.
Para iniciar a microinjeção de organoides, colha a bactéria H. pylori e lave-as em meio basal de acordo com os protocolos padrão. Após medições de densidade óptica para determinar o número de bactérias, diluir a cultura para 1 x 109 bactérias por mililitro em meio basal.
Puxe o capilar de vidro em duas agulhas de injeção usando um extrator de micropipeta e guarde em uma placa de Petri limpa. Em seguida, usando uma pinça, quebre a ponta de uma agulha de injeção para produzir uma abertura de aproximadamente 10 micrômetros de largura.
Trabalhando em um estereomicroscópio, instale dentro de uma capa de cultura estéril, insira a agulha no suporte de injeção e fixe-a no micromanipulador. Pegue aproximadamente 10 microlitros da solução bacteriana na agulha. Em seguida, coloque a placa de cultura de células de 4 poços contendo organoides gástricos sob o estereomicroscópio.
Navegando com o micromanipulador, posicione a agulha perto de um organoide. Insira a agulha no organoide com um movimento rápido e, em seguida, injete aproximadamente 0,2 microlitros de solução bacteriana no centro do organoide. Com a experiência, aproximadamente 30 dos maiores organoides em um poço podem ser injetados em 5 minutos. Incubar os organoides injetados pelo tempo desejado em uma incubadora de cultura de células.
Freqüentemente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque acham difícil direcionar os organoides com eficiência. Os organoides gástricos de camundongos crescem císticos e são os mais fáceis de atingir. Portanto, a injeção de organoides gástricos de camundongos com, por exemplo, um corante, pode ser uma boa prática para essa técnica.