Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:13 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo células epiteliais aderidas e trate-a com mutantes de Coxiella marcados com proteína fluorescente verde; alguns com mutações no gene do sistema de secreção tipo IV, ou gene T4SS - crucial para a replicação.
Os mutantes replicativos interagem com as células epiteliais, desencadeando o engolfamento de Coxiella, formando vacúolo contendo Coxiella, ou CCV, e recrutando glicoproteína-1 de membrana associada ao lisossomo, ou LAMP1 para CCV.
Isso facilita a secreção de proteínas efetoras no citoplasma celular por meio do sistema de secreção tipo IV, promovendo a replicação bacteriana.
Mutantes com mutações no gene T4SS permanecem não replicados.
Após a incubação, corar as células com um corante fluorescente, fixá-las e permeabilizar a membrana celular.
Introduzir anticorpos primários específicos para LAMP1 interagindo com as proteínas LAMP1 no CCV.
Sobreponha-se com anticorpos secundários marcados com fluoróforo vermelho, interagindo com anticorpos primários, enquanto o corante Hoechst cora os núcleos das células.
Sob um microscópio de epifluorescência, vacúolos de fluorescência vermelha contendo menos Coxiella verde perto do núcleo indicam replica
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