Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:28 min. • July 8th, 2025
Comece com uma cultura de células endoteliais.
Substitua o meio por meio anaeróbico. Incubar em uma câmara anaeróbica para equilíbrio de temperatura.
Adicione Porphyromonas gingivalis, uma bactéria anaeróbica patogênica, e incube brevemente.
As bactérias possuem projeções proteicas, conhecidas como fímbrias, que se ligam a moléculas de adesão específicas nas células endoteliais, facilitando a adesão bacteriana.
Essa ligação desencadeia cascatas de sinalização intracelular, resultando no rearranjo do citoesqueleto de actina e na internalização bacteriana em fagossomos.
Pós-incubação, remova a mídia. Lave com um tampão anaeróbico para remover bactérias extracelulares não aderidas.
Adicione um detergente neutro para permeabilizar as membranas das células hospedeiras e induzir a lise celular, liberando bactérias internalizadas e ligadas à superfície sem causar danos.
Diluir as bactérias que contêm lisado com meios e preparar diluições em série.
Coloque essas diluições em placas de ágar sangue. Incubar em condições anaeróbicas para permitir que Porphyromonas gingivalis prolifere e forme colônias.
Após a incubação, conte as unidades formadoras de colônias (UFCs) em cada placa para quantificar as bactérias aderidas à superfície e internalizadas, indicando as interações bactéria-célula hospedeira.
Para cultivo e experimentação com Porphyromonas gingivalis, uma câmara anaeróbica de vinil é mantida com uma atmosfera artificial contendo 80% de nitrogênio, 10% de hidrogênio e 10% de dióxido de carbono.
Coloque 30 placas de ágar sangue, 500 mililitros de PBS e mililitros de fator de crescimento endotelial vascular, ou meio VEGF, dentro da câmara anaeróbica com 24 horas de antecedência para equilibrar os reagentes.
Semeie 4 vezes 10 para as 5 células endoteliais da veia umbilical humana, ou HUVECs, por poço em placas de seis poços em meio VEGF e deixe-as na incubadora de cultura de células durante a noite para fixação. Prepare culturas de Porphyromonas gingivalis em infusão cérebro-coração, ou meio BHI, conforme descrito no texto anexo, e permita que as culturas atinjam a fase logarítmica enquanto a densidade óptica da cultura em 660 nanômetros varia entre 0,5 e 0,7.
Transfira as bactérias para um tubo de 15 mililitros e enrole um pedaço de parafilme ao redor da tampa para evitar a exposição aeróbica. Em seguida, centrifugue as bactérias a 5.000 vezes g por 10 minutos. Dentro da câmara anaeróbica, lave as bactérias peletizadas com PBS anaeróbico e gire novamente a 5.000 vezes g por 10 minutos. Ressuspenda as bactérias em meio VEGF.
Para infectar os HUVECs com Porphyromonas gingivalis, transfira as placas de seis poços da incubadora para a câmara anaeróbica. Aspirar o meio dos alvéolos de ensaio e lavar três vezes com PBS anaeróbico.
Determine o número de células de um poço representativo pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. Em seguida, adicione 2 mililitros por poço de meio anaeróbico VEGF e coloque as placas a 37 graus Celsius na incubadora anaeróbica por 20 minutos para equilibrar.
Determine a densidade óptica das bactérias e ressuspenda-as em um volume adequado de meio VEGF para infectar as células em uma multiplicidade de infecção de 100 para 1 proporção de bactérias para células. Adicione a suspensão bacteriana às células e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius para infecção. Para lise celular, dentro da câmara anaeróbica, prepare uma solução de saponina a 1% em peso por volume em meio BHI e filtre através de um filtro de 0,2 mícron.
Para estudar as interações bacterianas com as células hospedeiras, remova a placa de seis poços da incubadora e aspire o meio de infecção. Lave três vezes com PBS anaeróbico. Em seguida, adicione 2 mililitros de solução de saponina a cada poço e incube por 15 minutos para permitir a lise celular.
Em seguida, raspe as células do fundo do poço e dilua o lisado celular 1 a 1 com meio BHI. Em seguida, faça diluições em série começando de 1 a 100. Placa 200 microlitros de uma diluição adequada em placas de ágar sangue. Envolva as placas com parafilme e incube-as em uma incubadora anaeróbica a 37 graus Celsius por sete dias para permitir a formação de colônias. Em seguida, usando uma caixa de luz, conte as unidades formadoras de colônias, ou UFCs, em cada placa.