Visualização de bactérias anaeróbicas internalizadas dentro das células endoteliais do hospedeiro

Comece com uma suspensão de Porphyromonas gingivalis em crescimento ativo, bactérias patogênicas anaeróbicas.

Adicione BCECF-AM, um corante não fluorescente e permeável às células.

As esterases citoplasmáticas ativas hidrolisam o corante em uma forma fluorescente e impermeável às células, corando as bactérias.

centrifuga. Ressuspenda as bactérias em meio anaeróbico.

Adicione as bactérias marcadas a poços de placas de vários poços contendo lamínulas com células endoteliais humanas aderidas.

Incubar em câmara anaeróbica.

As fímbrias bacterianas se ligam aos receptores da superfície celular endotelial, iniciando cascatas de sinalização intracelular.

Isso leva ao rearranjo da actina e à internalização bacteriana dentro dos fagossomos.

Pós-incubação, lave as lamínulas com tampão para remover bactérias não internalizadas.

Fixe as células com paraformaldeído para preservar as estruturas celulares. Permeabilize as células com um detergente não iônico para acessar alvos intracelulares.

Adicione a faloidina marcada com fluorescência, que se liga aos filamentos de actina.

Coloque a lamínula sobre um meio de montagem contendo DAPI, que mancha o DNA.

Observe as Porphyromonas gingivalis fluorescentes dentro das células endoteliais com actina fluorescente, confirmando a internalização bacteriana.

Para visualizar bactérias internalizadas, primeiro transfira assepticamente lamínulas de vidro autoclavadas dentro de cada poço de uma placa de 12 poços. Placa cinco vezes 10 aos quatro HUVECs por poço na lamínula e incubar por 24 horas. Para rotular bactérias, centrifugue bactérias da fase intermediária e ressuspenda o pellet com PBS anaeróbico. Centrifugue novamente e repita a etapa de lavagem.

Adicione 20 microlitros de BCECF-AM 0,2 milimolar a dois mililitros de PBS anaeróbico contendo cinco a sete vezes 10 elevado à oitava bactéria por mililitro. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos no escuro.

O corante fluorescente que usamos pode manchar a maioria das bactérias anaeróbicas. Assim, nenhum outro reagente, como um anticorpo específico, é necessário.

Centrifugue a suspensão bacteriana a 5.000 vezes g por 10 minutos para remover o reagente de marcação não ligado e ressuspenda as bactérias em meio VEGF. Em seguida, infecte as células HUVEC na proporção de 100 para 1, bactérias para células e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, remova o meio de infecção e lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 4% de paraformaldeído e incube em temperatura ambiente por 10 minutos para fixar as células na câmara anaeróbica.

Remova as células fixas da câmara e, em seguida, lave as lamínulas com PBS três vezes. Incube as lamínulas em um mililitro de Triton X-100 a 0,2% por 10 minutos para permeabilizar as células. Em seguida, lave as lamínulas com PBS três vezes. Agora, adicione 50 microlitros de 50 microgramas por mililitro de faloidina TRITC a cada lamínula e incube por 45 minutos em temperatura ambiente para corar a actina oligomérica celular.

Após a incubação, lave a lamínula com PBS três vezes. Inverter a lamínula numa lâmina de vidro com um meio de montagem de endurecimento macio contendo um micrograma por mililitro DAPI para coloração nuclear. Em seguida, sele a periferia da lamínula com esmalte e observe em microscopia confocal.