JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:29 min • July 8th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo uma suspensão de Streptococcus pneumoniae.
Introduzir anticorpos direcionados ao antígeno de superfície bacteriana, que interagem com antígenos de superfície bacteriana. Isso reveste as bactérias com anticorpos, formando bactérias opsonizadas para reconhecimento imunológico.
Semeie os poços com neutrófilos derivados de linfócitos do sangue periférico humano suplementados com soro de coelho contendo proteínas do complemento.
Durante a incubação, as proteínas do complemento, como C3b, são depositadas na superfície bacteriana, levando a um revestimento adicional de opsonina nas bactérias opsonizadas por anticorpos - aumentando o reconhecimento bacteriano pelos neutrófilos.
Os receptores de superfície específicos nos neutrófilos interagem com as opsoninas nas bactérias, facilitando o engolfamento bacteriano por meio da fagocitose.
Dentro do fagossomo, os neutrófilos degradam as bactérias engolfadas, reduzindo a contagem bacteriana no tampão.
Após a incubação, coloque a solução de co-cultura diluída em uma placa de ágar sangue para permitir que bactérias individuais formem colônias.
Compare o número de colônias em bactérias tratadas com opsonina com bactérias não tratadas.
Menos colônias com tratamento com opsonina indicam maior morte bacteriana, sugerindo morte opsonofagocítica bem-sucedida.
Descongele um tubo de caldo bacteriano. Pellet bactérias a 6.000 vezes g por dois minutos e ressuspenda o pellet celular em OBB na diluição ideal obtida na etapa anterior. Pipetar 10 microlitros da diluição bacteriana ressuspensa por alvéolo numa placa de cultura de células de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, adicione 20 microlitros de um anticorpo apropriado ou um tratamento medicamentoso a cada poço experimental em duplicata.
Para poços de controle, use 1X PBS ou OBB, dependendo do tampão usado para os poços de tratamento. Agitar a placa de recolha a cerca de 90 RPM à temperatura ambiente durante uma hora.
Para colher as células diferenciadas por HL60 que são tratadas com DMF três dias antes, pulverize as células a 500 vezes g por três minutos. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com pelo menos 10 mililitros de 1XPBS. Pelete as células lavadas a 500 vezes g durante três minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em OBB.
Adicione soro de coelho bebê estéril não diluído em um volume final de um a cinco. Após uma cultura bacteriana de uma hora, divida cada amostra em poços duplicados para dois grupos. Em seguida, adicione 50 microlitros da mistura de complemento HL60 a cada conjunto experimental de poços e 50 microlitros de OBB apenas aos poços de bactérias. Agite a placa de 96 poços a 37 graus Celsius por uma hora.
Para plaquear as amostras, diluir cada poço com OBB em um volume final de um a cinco, de modo que cada amostra tenha um volume de pelo menos 50 microlitros. Em seguida, pipete 50 microlitros de cada amostra diretamente em uma área designada de uma placa de cultura bacteriana, garantindo o espaçamento adequado entre as amostras. Cubra e deixe as amostras secarem por aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente.
Inverta as placas e cultive durante a noite a 30 graus Celsius. Alternativamente, placas de cultura em frascos anaeróbicos, para testar se as condições anóxicas afetam o crescimento bacteriano ou para controlar a morfologia. Após a cultura durante a noite, conte as colônias em cada área de amostra designada e prossiga para a análise dos dados comparando o número de células vivas em cada conjunto com os controles correspondentes.
Os aspectos mais difíceis de estabelecer essa técnica pela primeira vez provavelmente serão otimizar as UFC iniciais do estoque bacteriano, bem como garantir que as células HL60 sejam efetivamente diferenciadas.