Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:37 min. • July 8th, 2025
Durante a infecção por Porphyromonas gingivalis, as fímbrias das bactérias anaeróbicas se ligam a receptores específicos nas células hospedeiras.
Essa ligação inicia cascatas de sinalização intracelular, resultando em rearranjo de actina e internalização bacteriana dentro dos fagossomos.
Para avaliar a sobrevivência de Porphyromonas gingivalis internalizadas dentro das células endoteliais in vitro, pegue uma placa de vários poços contendo células endoteliais aderidas a lamínulas.
Adicione a suspensão de Porphyromonas gingivalis. Incubar para facilitar a internalização bacteriana.
Remova o meio e lave usando um tampão anaeróbico para remover bactérias não internalizadas.
Adicione meios contendo antibióticos, impermeáveis às células endoteliais, para eliminar as bactérias aderidas à superfície.
Incube com um surfactante suave para lisar as células endoteliais, liberando as bactérias sem causar sua lise.
Diluir o lisado recolhido com meios. Preparar diluições seriadas do lisado.
Colocar as diluições em placas de ágar sangue. Incube em condições anaeróbicas para que Porphyromonas gingivalis cresça e forme colônias visíveis.
Conte as colônias para avaliar a capacidade de Porphyromonas gingivalis de invadir e sobreviver dentro das células endoteliais.
Após a infecção das células HUVEC, lave as células três vezes com PBS anaeróbico. Em seguida, adicione 2 mililitros de meio VEGF suplementado com concentrações pré-otimizadas de antibióticos às células HUVEC. Incube as células por uma hora. Aspire o meio e adicione 2 mililitros de solução de saponina a 1% em BHI a cada poço. Incube por 15 minutos.
Em seguida, raspe as células lisadas e colete o lisado em um tubo de centrífuga. Diluir o lisado 1 a 1 com meio BHI e, em seguida, preparar diluições seriadas a partir de 1 a 100. Placa 200 microlitros das concentrações adequadas em placas de ágar sangue. Deixe a bactéria crescer por sete dias em uma câmara anaeróbica e, em seguida, conte as colônias.