JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:18 min • July 8th, 2025
Comece com subpopulações de macrófagos M1 e M2 aderentes, distinguidas por seus marcadores de superfície específicos. Essas células estão infectadas com Mycobacterium tuberculosis marcado com fluorescência.
Adicione o buffer FACS aos poços de cultura.
O EDTA no tampão permite o desprendimento celular dos poços de cultura.
Transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga.
Centrifugue os tubos. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em um coquetel de anticorpos antimacrófagos conjugado com fluorocromo e corante de viabilidade, Zombie-UV.
O corante de fluorescência Zombie-UV entra nas células mortas através de membranas danificadas e se liga a proteínas citoplasmáticas, permitindo uma diferenciação clara de células viáveis não coradas.
Além disso, os anticorpos antimacrófagos conjugados com fluorescência se ligam a antígenos-alvo nos macrófagos, permitindo a detecção diferencial de subpopulações.
Lave as células para remover anticorpos não ligados. Centrifuga. Remova o sobrenadante.
Ressuspenda as células em um tampão fixador para reticular proteínas, preservando a morfologia celular e inativando micobactérias para manuseio seguro durante a análise.
Finalmente, centrifugue e processe as amostras para citometria de fluxo.
Use uma estratégia de gating apropriada para determinar a porcentagem de subpopulações infectadas por Mycobacterium.
Para corar as células para citometria de fluxo, incube as células infectadas com 1 mililitro de tampão FACS suplementado com EDTA 0,5 milimolar por poço por pelo menos 30 minutos. No final da incubação, colete as células destacadas com pipetagem suave e transfira as células para tubos de microcentrífuga individuais com tampa de rosca para centrifugação.
Ressuspenda as células em aproximadamente 50 microlitros de coquetel de anticorpos anti-humanos conjugados com fluorocromo e corante de viabilidade de interesse e incube as células por 30 minutos a 4 graus Celsius protegidas da luz.
Após a lavagem, fixe as células com 200 microlitros de tampão de fixação recém-preparado por 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz. Após a fixação e lavagem, ressuspenda as células em 400 microlitros de tampão FACS e transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1 mililitro.
Para analisar as células, use contas de compensação para compensar o sinal fluorescente para cada anticorpo conjugado com fluorocromo no coquetel e use células não coradas para definir a porta para a população de células negativas. Em seguida, adquira um mínimo de 50.000 células por amostra.