Um ensaio in vitro para estudar a capacidade citotóxica de células assassinas induzidas por citocinas

Faça uma cultura de células cancerígenas com proteínas citoplasmáticas marcadas com fluorescência.

Adicione células assassinas induzidas por citocinas ou CIK - células T efetoras com características semelhantes a células assassinas naturais - possuindo atividade antitumoral.

Os receptores do grupo 2 natural killer do membro D ou NKG2D nas células CIK se ligam a proteínas induzíveis por estresse nas células cancerígenas.

A ligação induz as células CIK a liberar toxinas de grânulos citoplasmáticos - perforinas e granzimas.

As perforinas formam poros na membrana celular cancerígena, permitindo a entrada de granzimas, que ativam as caspases, induzindo a apoptose.

Após a incubação, colha as células. Adicione um corante fluorescente de viabilidade celular de ligação a ácidos nucleicos.

O corante entra pela membrana celular danificada e se liga ao DNA, resultando em células mortas com coloração dupla.

Com uma membrana celular intacta, as células vivas são impermeáveis ao corante.

Passe as células por um citômetro de fluxo para detectar células vivas exibindo fluorescência única e células mortas com fluorescência dupla.

Crie um gráfico de dispersão para medir a porcentagem de células cancerígenas mortas, quantificando o efeito citotóxico das células CIK.

Para realizar o ensaio citotóxico, co-cultive células CIK e leucemia mielóide crônica humana K562, adicionando 1 mililitro de células K562 a cada poço em uma placa de 6 poços a uma densidade de 0,5 milhão de células por mililitro. Em seguida, adicione 1 mililitro de meio basal com ou sem células CIK à placa de 6 poços, conforme listado no protocolo de texto. Misture as suspensões celulares pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos três vezes.

Coloque a placa na incubadora por 24 horas. Agora, co-cultive células CIK e OC-3 ovarianas adicionando 1 mililitro de meio basal com ou sem células CIK à placa de 6 poços, conforme listado no protocolo de texto. Misture as suspensões celulares pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos três vezes com a lâmina na incubadora por 24 horas. Após a incubação, colha a suspensão celular CIK-K562 diretamente em um tubo estéril de 15 mililitros.

Para colher a suspensão e as células aderentes dos grupos CIK-OC-3, primeiro transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 15 mililitros. Lave o poço com 1 mililitro de PBS estéril. Colete o PBS e adicione-o ao tubo. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de solução enzimática de dissociação celular e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Adicione 1 mililitro da solução do mesmo tubo ao poço correspondente e misture suavemente as células pipetando para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de 1 mililitro. Colete todas as células no mesmo tubo. Centrifugue a 300 x g durante 10 minutos. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mililitro de PBS estéril. Pulverize as células a 300 x g por 10 minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 microlitros de PBS estéril.

Adicione 5 microlitros de corante 7-AAD à suspensão celular. Misture suavemente as células pipetando para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de 1 mililitro. Incubar durante 10 minutos e deixar no escuro antes da análise.

Para realizar o ensaio de capacidade citolítica, misture a suspensão celular e repita a preparação para citometria de fluxo. Clique no botão Novo espécime para adicionar um espécime e um tubo ao experimento. Nomeie os tubos conforme listado no protocolo de texto.

Para criar um sistema de passagem de dispersão para o ensaio citolítico, primeiro selecione o Tubo 1 e clique no botão Dot Plot. Para criar um gráfico FSC-A/SSC-A, desenhe uma porta retangular sobre todos os eventos com um limite FSC-A maior que 50.000 para excluir detritos de células. Selecione o parâmetro SSC-A/CFSE para o novo gráfico de pontos. Em seguida, selecione o parâmetro 7-AAD/CFSE para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.

Clique no botão Carregar Amostra para analisar primeiro a amostra de controle em branco. Ajuste a tensão de SSC-A e FSC-A. Identifique a população de células mortas usando os parâmetros de canal CFSE e 7-AAD. Registre os dados de mais de 20.000 células positivas para CFSE em cada amostra. Abra os arquivos que contêm os valores estatísticos de cada espécime individual para analisar as populações de células não viáveis e exporte os dados para arquivos de análise.