Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:57 min. • July 8th, 2025
Comece com um tubo contendo uma cultura bacteriana na fase exponencial, garantindo bactérias uniformes e de crescimento ativo para resultados consistentes.
Centrifugue para coletar as células; aspire o sobrenadante contendo detritos e ressuspenda as células.
Introduza um corante fluorescente vermelho permeável às células. As moléculas de corante penetram na membrana celular bacteriana e atingem o nucleóide, ligando-se ao DNA e transmitindo fluorescência vermelha às bactérias.
Centrifugue para pellet as bactérias coradas e aspire o sobrenadante contendo corante não ligado.
Ressuspenda as bactérias em um meio de crescimento para manter a viabilidade celular.
Com um fotómetro, medir a absorvância da suspensão bacteriana diluída a 600 nanómetros.
Compare o valor de absorbância com uma curva padrão para determinar a concentração bacteriana.
Transfira o volume desejado da suspensão bacteriana corada para um novo tubo contendo um meio de crescimento. Isso é para atingir a concentração bacteriana desejada para a infecção da célula hospedeira que representa a multiplicidade de infecção, ou MOI.
As bactérias coradas com o MOI desejado estão prontas para estudos imunológicos.
Primeiro, colha as culturas bacterianas em uma fase exponencial por centrifugação a 13.000 vezes g por dois minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar o pellet celular com um mililitro de PBS, ressuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de PBS.
Determine as concentrações de suspensão bacteriana medindo a densidade óptica em 600 nanômetros. Em seguida, para corar a suspensão bacteriana, adicione dois microlitros do corante verde ou vermelho concentrado de 500 vezes em um mililitro de suspensão bacteriana para diluir o corante uma vez. Incube as células em temperatura ambiente por 30 minutos com rotação suave no escuro.
Após 30 minutos, centrifugue as bactérias coradas a 13.000 vezes g por dois minutos e ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS. Colete as células bacterianas coradas por centrifugação a 13.000 vezes g por dois minutos. Ressuspenda o pellet em um mililitro de meio F-12K fresco e meça a densidade óptica de cada cultura em 600 nanômetros. Diluir subsequentemente as culturas até as concentrações desejadas, com base na multiplicidade de infecção e concentração de células hospedeiras.