Avaliação da fosforilação de proteínas intracelulares induzida por citocinas estromais usando citometria de fluxo fosfométrica

Pegue células de leucemia em meios de crescimento sem fatores estimulantes, como citocinas, e incuba-as.

A ausência de fatores estimulantes permite que as proteínas fosforiladas intracelulares sofram desfosforilação e retornem aos seus estados nativos.

Centrifugue e remova a mídia. Ressuspenda as células no sobrenadante do estroma contendo a citocina, linfopoietina estromal tímica ou TSLP.

O TSLP se liga ao seu receptor na célula de leucemia, desencadeando a dimerização do receptor.

Isso aproxima as duas quinases associadas a Janus, ou JAKs, facilitando a transfosforilação mútua.

As JAKs ativadas fosforilam as caudas citoplasmáticas do receptor, criando locais de ancoragem para o transdutor de sinal e ativador da transcrição, monômeros STAT.

Uma vez fosforilados, os STATs dimerizam e se desprendem do receptor para regular os processos celulares a jusante.

Fixe as células para manter os estados de fosforilação das proteínas intracelulares.

Trate as células com uma solução de permeabilização para aumentar a permeabilidade da membrana celular.

Adicione anticorpos marcados com fluorescência para marcar as proteínas fosforiladas.

A medição por citometria de fluxo do sinal de fluorescênc