Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:40 min. • July 8th, 2025
Pegue células de leucemia em meios de crescimento sem fatores estimulantes, como citocinas, e incuba-as.
A ausência de fatores estimulantes permite que as proteínas fosforiladas intracelulares sofram desfosforilação e retornem aos seus estados nativos.
Centrifugue e remova a mídia. Ressuspenda as células no sobrenadante do estroma contendo a citocina, linfopoietina estromal tímica ou TSLP.
O TSLP se liga ao seu receptor na célula de leucemia, desencadeando a dimerização do receptor.
Isso aproxima as duas quinases associadas a Janus, ou JAKs, facilitando a transfosforilação mútua.
As JAKs ativadas fosforilam as caudas citoplasmáticas do receptor, criando locais de ancoragem para o transdutor de sinal e ativador da transcrição, monômeros STAT.
Uma vez fosforilados, os STATs dimerizam e se desprendem do receptor para regular os processos celulares a jusante.
Fixe as células para manter os estados de fosforilação das proteínas intracelulares.
Trate as células com uma solução de permeabilização para aumentar a permeabilidade da membrana celular.
Adicione anticorpos marcados com fluorescência para marcar as proteínas fosforiladas.
A medição por citometria de fluxo do sinal de fluorescência se correlaciona com a fosforilação STAT induzida por TSLP.
Para validar o sobrenadante produzido a partir do estroma projetado, descongele as amostras de sobrenadante colhidas do controle no estroma que expressa citocinas e coloque 3 poços de linhagens celulares de leucemia por condição em meio R20 em uma concentração de 2 vezes 10 elevado ao quinto células por poço em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Incube as células por duas horas a 37 graus Celsius para permitir que a fosforilação de sua cultura anterior seja perdida.
Em seguida, transfira as células de cada poço para tubos individuais de 4 mililitros e colete as células por centrifugação. Ressuspenda os pellets em 600 microlitros por condição experimental e coloque 200 microlitros de células por poço para cada condição em triplicata. Incubar as células durante o período adequado, de acordo com o fosfoensaio comercial específico.
No final da incubação, pelete as células por centrifugação e rotule as células por meio de coloração por citometria de fosfofluxo de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo usando protocolos padrão de análise de citometria de fluxo para verificar se a citocina no sobrenadante do estroma fosforila as células leucêmicas.