Visualização de bactérias em seções de biópsia de bexiga via hibridização in situ fluorescente

Comece com uma lâmina de vidro carregando uma seção de tecido de biópsia da bexiga urinária infectada desparafinizada e reidratada contendo bactérias uropatogênicas.

Introduza sondas universais marcadas com fluorescência - um oligonucleotídeo de fita simples complementar específico para a região conservada do RNA ribossômico 16s bacteriano, ou 16s-rRNA.

Incube a lâmina no escuro a uma temperatura elevada para uma hibridização ideal.

Durante a incubação, as sondas hibridizam exclusivamente com a região conservada no 16s-rRNA bacteriano, conferindo fluorescência verde às bactérias.

Após a hibridização, lave com um tampão pré-aquecido para remover as sondas não ligadas.

Manchar a seção de tecido com corante Hoechst e marcadores de proteína celular marcados com fluoróforo.

As moléculas de Hoechst se ligam ao DNA, colorindo os núcleos de azul, enquanto os marcadores marcados com fluoróforo interagem com componentes celulares específicos, como filamentos de mucina e actina, conferindo fluorescência vermelha na seção de biópsia.

Lave a lâmina e adicione mídia de montagem à seção de tecido.

Sob um microscópio confocal, a fluorescência verde dentro da seção de biópsia da bexiga que transporta fluorescência vermelha confirma as bactérias associadas ao tecido.

Prepare uma câmara umidificadora para cada sonda adicionando um lenço umedecido, amassado e delicado e água estéril ao reservatório de uma caixa de ponteiras P1000. Coloque o cartucho porta-pontas em cima, pois é aqui que as lâminas ficarão. Quando a lavagem final estiver concluída, remova a lâmina do rack de slides e coloque-a sobre uma toalha de papel limpa, com o lenço de papel voltado para cima. Use um lenço delicado para secar a lâmina, tomando cuidado para apenas passar suavemente perto, mas não na seção de biópsia, para absorver a água. Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe uma borda ao redor da seção de biópsia e coloque a lâmina com o lado do tecido para cima na câmara umidificadora.

Em seguida, coloque a câmara umidificadora em uma incubadora ajustada para 50 graus Celsius. Pipete entre 50 e 150 microlitros da solução de coloração diretamente sobre o tecido para que o retângulo feito pela borda hidrofóbica ao redor do tecido seja preenchido e feche a caixa com cuidado. Incube durante a noite a 50 graus Celsius no escuro. Se a incubadora tiver uma janela, cubra-a com papel alumínio para criar um ambiente escuro.

Na manhã seguinte, remova as lâminas das câmaras de umidificação e remova rapidamente qualquer solução de hibridização restante com uma limpeza delicada. Em seguida, coloque as lâminas em um rack de coloração vertical. Coloque o rack de coloração em um frasco de coplin embrulhado em papel alumínio contendo 100ml do tampão de lavagem pré-aquecido por 10 minutos. Repita esta etapa de lavagem mais duas vezes com tampão de lavagem fresco em novos frascos de coplin.

Durante essas etapas de lavagem, prepare a contracoloração diluindo uma solução estoque de Hoechst 33342 em tampão de lavagem na proporção de 1 para 1.000. Ao mesmo tubo, adicione a aglutinina de gérmen de trigo Alexa-555 a uma concentração final de cinco microgramas por mililitro e a faloidina Alexa-555 a uma concentração final de 33 nanomolares. Armazene no escuro até a hora de usar.

Quando a lavagem final estiver concluída, remova as lâminas do frasco de coplin e remova suavemente o excesso de tampão de lavagem com uma limpeza delicada. Coloque as lâminas com o lado do tecido para cima em uma toalha de papel e adicione entre 50 e 150 microlitros de contracoloração diretamente em cima do tecido para que a borda hidrofóbica seja preenchida, mas não transborde. Cubra até quatro lâminas com uma tampa de caixa criogênica e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Depois disso, coloque as lâminas de volta no rack de coloração e lave-as mais duas vezes em potes de coplin contendo tampão de lavagem fresco, com cada lavagem durando 10 minutos. Em seguida, seque bem as lâminas e coloque-as com o lado do tecido para cima em uma toalha de papel sob uma tampa de caixa criogênica. Aperte uma gota de mídia de montagem diretamente em cima do lenço e coloque suavemente uma lamínula de tamanho apropriado em cima. Delicadamente, pressione as bolhas e deixe as lâminas de cobertura curarem durante a noite no escuro. No dia seguinte, sele as bordas das lamínulas na lâmina com uma leve camada de esmalte transparente e deixe secar no escuro por 10 minutos, antes de armazená-las no escuro a 4 graus Celsius.

Quando estiver pronto para obter imagens das biópsias coradas, ligue o microscópio confocal e o software associado ao microscópio. Comece com um slide positivo para FISH e mude para o modo de visualização do computador. Selecione os canais para 405, 488 e 555. Defina o orifício usando o canal de comprimento de onda mais longo, que neste caso é 555. Em seguida, encontre o plano focal atual para visualização de bactérias marcadas no canal 488. Sem alterar o plano focal, defina o ganho, a potência do laser e o deslocamento para cada canal, de modo que o sinal não fique saturado e o fundo não seja corrigido em excesso. Adquira a imagem em todos os três canais.