JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Tome uma suspensão de células de Jurkat - células de leucemia de linfócitos T.
Misture uma alíquota com um corante de viabilidade celular e garanta um número adequado de células vivas.
Coloque as células em uma placa de cultura e aplique radiação ultravioleta C ou UVC pela duração necessária.
O UVC penetra nas células e é absorvido pelo DNA, formando fotoprodutos de pirimidina.
Pós-irradiação, incubar as células. Extensos danos ao DNA mediados por UVC iniciam a via intrínseca da apoptose, ativando proteínas pró-apoptóticas na membrana mitocondrial externa.
As proteínas ativadas oligomerizam, formando poros de membrana e liberando o citocromo C do espaço intermembranar para o citoplasma.
O citocromo C se complexa com o fator de ativação da protease apoptótica-1, formando um complexo de apoptossomos. O apoptossomo ativa caspases, causando apoptose.
Introduza a anexina V marcada com fluoróforo para marcar a fosfatidilserina na membrana, um marcador de células apoptóticas, e adicione iodeto de propídio que entra pela membrana danificada para marcar o DNA.
Usando citometria de fluxo, determine as células apoptóticas precoces marcadas com anexina V e as células apoptóticas tardias com coloração dupla.
Comece cultivando células T Jurkat em meio de cultura de células basais, suplementado de acordo com as instruções do manuscrito, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. As células T Jurkat são uma linha celular em suspensão que pode ser mantida por meio de passagem para meios de cultura pré-aquecidos a cada três dias.
Prepare as células apoptóticas cultivando-as até 90% de confluência, o que leva de três a quatro dias após a passagem. Cultivar células em cinco frascos T75, para obter um número suficiente de células para este protocolo. Quando as células estiverem prontas, aspire o conteúdo do frasco cerca de 24 mililitros e transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros. Conte as células usando coloração com azul de tripano e um hemocitômetro.
Pulverizar as células por centrifugação a 271 vezes g durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em meio para obter três milhões de células por mililitro. Aliquote as células em placas de cultura de tecidos de 100 por 20 milímetros, transferindo cinco mililitros de células por placa.
Prepare aproximadamente nove pratos de cultura. Reserve um prato como controle não exposto e exponha os pratos restantes aos raios UV. Defina o reticulador UV para o nível de energia correto pressionando o botão de energia e digitando "600" com o teclado numérico. Irradie todas as placas com as células, exceto o controle, certificando-se de remover a tampa superior da placa de cultura de tecidos durante a exposição aos raios UV.
Em seguida, incube todos os pratos em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Após a incubação, combinar todas as células irradiadas num tubo cónico de 50 mililitros e pulverizá-las por centrifugação a 271 vezes g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 24 mililitros de PBS estéril. Centrifugue novamente o tubo e remova o sobrenadante.