Analisando a ativação de basófilos na presença de um alérgeno de teste usando citometria de fluxo

Pegue tubos citômetros contendo uma mistura de coloração composta por anticorpos monoclonais marcados com fluorescência suspensos em um tampão de estimulação.

Adicione concentrações decrescentes do alérgeno de teste em vários tubos. Adicione anticorpos anti-IgE a um tubo para servir como controle positivo mediado por IgE e adicione tampão a outro tubo para o controle negativo.

Pipete o sangue periférico humano para os tubos. Incubar.

Se o indivíduo for sensibilizado ao alérgeno de teste, essa exposição faz com que o alérgeno se ligue aos anticorpos IgE específicos do alérgeno ligados aos receptores Fc na superfície basófila.

Os alérgenos reticulam os receptores Fc ligados à IgE, causando ativação de basófilos.

Os basófilos sofrem degranulação, liberando grânulos intracelulares contendo mediadores inflamatórios, com a regulação positiva das moléculas CD63 e CD203c.

Os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência ligam-se a CD63, CD203c e CCR3 em basófilos, respectivamente.

Abaixe a temperatura para interromper a degranulação do basófilo.

Adicione tampão para lisar eritrócitos e fixar as células.

Usando um citômetro de fluxo, identifique os basófilos da população de linfócitos.

Usando CD63 como marcador de ativação, analise a ativação de basófilos em concentrações decrescentes de alérgenos.

Comece coletando sangue periférico em tubos heparinizados de 9 mililitros e coloque as amostras em um rotor para mantê-las em temperatura ambiente até que sejam necessárias para o protocolo experimental.

Rotule dois tubos citômetros de 5 mililitros cada para controle negativo e controle positivo. Além disso, rotule um tubo para cada um para as diferentes concentrações de alérgenos ou medicamentos que estão sendo testadas. Em seguida, coloque os tubos em um rack para que os tubos se encaixem perfeitamente sem escorregar.

Para o primeiro controle positivo, prepare uma solução 4 micromolar de N-formilmetionil-leucil-fenilalanina, ou fMLP, em 0,05% PBST para confirmar a qualidade dos basófilos. Para o segundo controlo positivo, preparar uma solução anti-IgE de 0,05 miligramas por mililitro utilizando PBST. Prepare a mistura de coloração adicionando 1 microlitro de cada um dos anticorpos CCR3-APC, CD203c-PE e CD63-FITC por 20 microlitros do tampão de estimulação. Em seguida, adicione 23 microlitros desta mistura de coloração a cada tubo.

Adicione 100 microlitros de PBST aos tubos de controle negativo, adicione 100 microlitros de fMLP a um dos tubos de controle positivo e adicione 100 microlitros de anti-IgE ao outro. Ao restante dos tubos, adicione 100 microlitros das diferentes concentrações de alérgenos ou medicamentos e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, adicione 100 microlitros de sangue a cada tubo suavemente para evitar hemólise. Em seguida, agite suavemente os tubos e incube-os por 25 minutos a 37 graus Celsius no banho termostático com agitação média.

Mantenha os tubos a 4 graus Celsius por pelo menos cinco minutos para interromper a degranulação. A cada tubo, adicione 2 mililitros de tampão de lise para lisar os eritrócitos. Vortex cada tubo e, em seguida, incube os tubos por 5 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue os tubos a 300 x g a 4 graus Celsius por 5 minutos. Em seguida, vire o rack na pia para decantar o sobrenadante enquanto as células permanecem no fundo dos tubos. Adicione 3 mililitros de PBST a cada tubo para lavar as células e agitar os tubos. Execute uma segunda rodada de centrifugação usando o mesmo conjunto de parâmetros e decantar o sobrenadante virando o rack para a pia. Em seguida, mantenha as amostras a 4 graus Celsius, protegidas da luz até a citometria de fluxo.

Conecte o citômetro de fluxo ao software do computador e espere até que o citômetro esteja pronto. Carregue as configurações do modelo e do instrumento conforme descrito no manuscrito do texto. Inicie o processo de aquisição de amostras.

Para selecionar basófilos ativados, primeiro obtenha os linfócitos do gráfico Side Scatter - Forward Scatter. Em seguida, obtenha os basófilos da população de linfócitos como células positivas para CD203c positivas para CCR3 e adquira pelo menos 500 basófilos por tubo. Defina o limite negativo para CD63 para aproximadamente 2,5% usando os tubos de controle negativo e analise as amostras.