JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:43 min • July 8th, 2025
Pegue um tubo contendo sangue humano recém-coletado e adicione um tampão de lise.
O detergente no tampão permeia a membrana celular, lisando as células e liberando ácidos nucléicos intracelulares, ou NAs, e nucleases.
Os agentes caotrópicos no tampão desnaturam as nucleases, evitando a degradação do NA.
Adicione partículas magnéticas de vidro ou MGPs - partículas magnéticas revestidas de sílica - e misture bem.
O baixo pH do tampão protona a sílica, produzindo uma carga positiva na superfície dos MGPs.
NAs carregados negativamente se ligam eletrostaticamente à superfície carregada, formando um complexo NA-MGP.
Sob um campo magnético, os complexos NA-MGP se acumulam na lateral do tubo.
Descarte o sobrenadante contendo detritos celulares e proteínas.
Execute várias etapas de lavagem ressuspendendo os complexos NA-MGP em um tampão de lavagem, aplicando um campo magnético para coletar os complexos e descartando o sobrenadante com os contaminantes restantes.
Ressuspenda os complexos em um tampão de eluição. O pH alto interrompe a interação NA-MGP, liberando os NAs. Os NAs eluídos estão prontos para ensaios a jusante.
Para purificar os ácidos nucléicos do sangue coletado, misture novamente o conteúdo do tubo girando o tubo de vácuo manualmente de 5 a 10 vezes. Despeje a alíquota preparada de MGPs diretamente no tubo de coleta de sangue e, em seguida, coloque uma nova tampa de um tubo de coleta de sangue não utilizado no tubo que contém a amostra. Coloque um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado e misture o conteúdo do tubo virando de 5 a 10 vezes.
Coloque o tubo no suporte magnético e mantenha um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado. Em seguida, vire o suporte magnético com o tubo algumas vezes para dispersar os MGPs antes que eles se acumulem na lateral do tubo com o ímã. Remova a tampa do tubo e descarte o conteúdo do tubo em um tubo de coleta de 50 mililitros usando uma pipeta descartável.
Despeje a alíquota preparada de WB1 diretamente no tubo de coleta de sangue e feche a tampa do tubo. Misture o conteúdo manualmente de 5 a 10 vezes. Em seguida, colete as contas na lateral do tubo usando o ímã e remova o líquido como antes. Ressuspenda as contas na alíquota preparada de WB2. Em seguida, descarte a solução e repita o procedimento com a alíquota preparada de WB3.
Finalmente, remova o tubo do suporte magnético e despeje a alíquota preparada de EB diretamente no tubo de coleta de sangue. Coloque a tampa no tubo e ressuspenda os MGPs batendo de 5 a 10 vezes com o dedo. Finalmente, use uma pipeta descartável de 1,5 mililitro para transferir uma gota dos MGPs ressuspensos para a mistura de reação de amplificação de ácido nucleico a jusante.