Medição da exocitose de mastócitos via liberação de proteína fluorescente vermelha monomérica do neuropeptídeo Y

Pegue mastócitos transfectados expressando NPY-mRFP, uma proteína de fusão contendo neuropeptídeo Y e proteína fluorescente vermelha monomérica, em seus grânulos secretores citoplasmáticos.

Remova a mídia. Pipetar tampão contendo cálcio com um reagente ativador, um ionóforo de cálcio e incubar.

Esses ionóforos induzem o influxo de cálcio, aumentando a concentração intracelular de cálcio e mobilizando grânulos secretores para a membrana plasmática.

O cálcio se liga a proteínas de ligação ao cálcio na membrana granular secretora.

Além disso, os grânulos secretores se fundem com a membrana plasmática mediada por proteínas ligadas à membrana, resultando em exocitose e liberação de conteúdo, incluindo NPY-mRFP.

Após a incubação, colete e transfira o sobrenadante contendo NPY-mRFP liberado para uma placa preta de vários poços.

Adicione um detergente não iônico para lisar as células e liberar o NPY-mRFP intracelular restante.

Colete e transfira o lisado celular para a placa de vários poços.

Usando um leitor de placa de fluorescência, meça a fluorescência do sobrenadante e lisado da célula para quantificar a porcentagem de NPY-mRFP liberada e determine a extensão da exocitose de mastócitos