Imagem de super-resolução da formação de sinapses imunológicas de células NK em uma bicamada lipídica suportada

Prepare uma lâmina de câmara com uma bicamada lipídica suportada, ou SLB, composta de fosfolipídios e fosfolipídios biotinilados.

Adicione proteínas bloqueadoras para evitar interações inespecíficas.

Introduza estreptavidina, que se liga aos fosfolipídios biotinilados.

Adicione anticorpos anti-CD16 marcados com fluorescência biotinilada, que se ligam à estreptavidina imobilizada.

Pipeta D-biotina para evitar a ligação não específica da estreptavidina às células.

Introduza células natural killer, ou NK. Os receptores CD16 nessas células se ligam especificamente a anticorpos anti-CD16 ligados à SLB, formando uma sinapse imunológica.

Essa ligação desencadeia o rearranjo da actina e a polarização dos microtúbulos, eventualmente formando microaglomerados no centro da sinapse contendo anticorpos anti-CD16 ligados à SLB e receptores CD16.

Os grânulos líticos contendo perforina polarizam e penetram através dos filamentos de actina na sinapse.

Corrija as células. Permeabilize as membranas e a SLB.

Adicione anticorpos de faloidina e anti-perforina marcados com fluorescência, que se ligam a filamentos de actina e perforina, respectivamente.

Usando um microscópio de fluorescência de super-resolução, visualize a distribuição de filamentos de actina fluorescentes e grânulos positivos para perforina na sinapse.

Para montar a bicamada lipídica planar suportada por vidro, primeiro prepare 100 mililitros de solução de piranha misturando peróxido de hidrogênio a 30% com ácido sulfúrico na proporção de 1 para 3 em um béquer. Nesta solução, coloque duas lamínulas retangulares # 1,5 por 20 a 30 minutos. Enquanto as lamínulas estão sendo limpas, recupere um tubo de lipídios DOPC de 400 micromolares previamente preparados e um tubo de lipídios de Biotina-PE de 80 micromolares previamente preparados. Transporte-os no gelo para o tanque de argônio.

Depois de desoxigenar um novo tubo de microcentrífuga com argônio, adicione o DOPC e a biotina-PE na proporção de 1 para 1. O volume específico varia de acordo com as necessidades experimentais, mas deve ser, no mínimo, de 2 microlitros cada. Desoxigenar o tubo de mistura e os tubos de reagentes individuais antes de voltar a colocá-los no frigorífico.

Depois de terminar a limpeza, enxágue bem as lamínulas com água destilada. Coloque as lamínulas para secar ao ar por alguns minutos. Em seguida, retire 1,5 microlitros da mistura de lipossomas e alicote em uma única gota em uma das câmaras de pista de uma lâmina de câmara. O uso de duas quedas por pista é típico, mas não necessário.

Agora, coloque a lamínula seca de forma rápida e eficiente sobre as gotículas. Certifique-se de que as gotas estejam suficientemente espaçadas para que não se fundam depois que a lamínula for colocada. Além disso, certifique-se de que as gotas permaneçam circulares e bem definidas, sem tocar nas bordas das paredes da câmara. Pressione com firmeza, entre e ao redor de cada faixa, para garantir uma vedação estanque entre a lamínula e a corrediça.

Marque as posições das gotas usando um marcador. Em seguida, passe 100 microlitros de caseína aquosa a 5% pela câmara para bloquear a bicamada. Tente certificar-se de que não há bolhas na câmara de fluxo. Em seguida, injete 100 microlitros de estreptavidina a uma concentração de 333 nanogramas por mililitro em cada pista.

Depois de incubar por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente, lave passando 3 mililitros de solução salina tamponada com HEPES com albumina sérica humana a 1% em cada pista para remover o excesso de estreptavidina. Adicionar 100 microlitros de anti-CD16 biotinilado e marcado com fluorescência na concentração de proteína previamente determinada, conforme descrito no protocolo de texto.

Após a incubação no escuro por 20 a 30 minutos, lave novamente passando 3 mililitros de solução salina tamponada com HEPES com albumina sérica humana a 1% em cada pista. Em seguida, flua 100 microlitros de D D-biotina a uma concentração de 25 nanomolares através da câmara para ligar qualquer excesso de estreptavidina e, assim, eliminar a chance de ligação inespecífica da estreptavidina às células.

Em seguida, conte as células NK humanas e ressuspenda-as a uma concentração de 500.000 por mililitro em solução salina tamponada com HEPES com albumina sérica humana a 1%. Lave a D-biotina para fora da câmara com mais 3 mililitros de solução salina tamponada com HEPES com albumina sérica humana a 1% por pista. Uma vez que as células tenham sido ressuspensas na concentração desejada, adicione 100 microlitros a cada pista. Coloque a câmara em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5% por 30 a 60 minutos.

Após este período de incubação, fixe as células com paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos. Lave passando 3 mililitros de solução salina tamponada com fosfato em cada pista para remover o paraformaldeído. Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de bloqueio antes de incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, core a F-actina e a perforina adicionando 200 microlitros de faloidina diluída marcada com fluorescência e anticorpo monoclonal anti-perforina marcado com fluorescência. Incube em temperatura ambiente por uma hora antes de lavar, passando 3 mililitros de solução salina tamponada com fosfato pela câmara. A câmara está pronta para a obtenção de imagens.

Para começar, ligue todos os módulos de hardware necessários do microscópio STED. Inicie o software de análise de imagem e ative os módulos de varredura ressonante e STED. Depois de fazer essas seleções, aguarde cerca de três a cinco minutos para que o software seja iniciado.

Clique na guia Configuração na parte superior da tela. Selecione Configuração de laser. Em seguida, ligue a luz branca e os lasers STED de 592 nanômetros. Escolha a objetiva 100X e alinhe o feixe de laser de excitação com um laser de depleção de 592 nanômetros. Selecione o módulo Laser Config. Desligue o laser de depleção 592 e ligue o laser de depleção de 660 nanômetros.

Coloque o slide sobre o palco sobre a lente. Focalize as células ligadas na região demarcada da bicamada, utilizando a lâmpada de luz branca e as oculares. Em seguida, retorne à guia Aquisição diretamente à direita da guia Configuração. Clique na guia Alternar para luz branca e, em seguida, ligue esse módulo e arraste a linha de laser de excitação para o comprimento de onda apropriado.

Depois de selecionar o detector desejado e definir o intervalo de detecção, clique no botão Sequencial na barra de ferramentas Adquirir à esquerda para abrir a caixa de diálogo de varredura sequencial na parte inferior da barra de ferramentas à esquerda. Isso permite que o usuário adicione várias sequências, cada uma com um feixe de excitação diferente para uma cor diferente. Clique entre os quadros e, em seguida, defina a frequência de excitação, o detector e o intervalo de detecção para cada cor adicional. Depois que todas as configurações estiverem otimizadas, clique em Iniciar para iniciar o processo de aquisição.