Preparação à base de agarose de fatias de pulmão humanas cortadas com precisão

Comece com um pulmão humano ressecado.

Insira um tubo de silicone no brônquio principal do pulmão. Prenda o tubo, fornecendo um caminho para a introdução de agarose no tecido nas etapas subsequentes.

Prenda outros brônquios e vasos para evitar vazamento de agarose durante o enchimento.

Introduza agarose pré-aquecida com baixo teor de gelificação misturada com meio no pulmão até que esteja totalmente inflada.

Coloque o pulmão no gelo para polimerização de agarose, formando uma matriz de gel sólido que fornece estabilidade ao tecido e mantém a arquitetura pulmonar durante os procedimentos de secção.

Após a polimerização, corte o tecido pulmonar em placas uniformes. Extraia núcleos de tecido cilíndricos das placas de tecido.

Usando um fatiador de tecido cheio de tampão resfriado, corte o núcleo de tecido para obter fatias de pulmão cortadas com precisão.

Transfira as fatias para uma placa de cultura contendo meios refrigerados. Incubar para estabilizar o tecido.

Por fim, transfira as fatias para uma placa de vários poços contendo meio. As fatias de pulmão preparadas com corte de precisão estão agora prontas para experimentos.

Para iniciar este procedimento, canule a traqueia inserindo o tubo de silicone e fixando-o com uma pinça paralela ao tubo para que a pinça aperte o tecido ao lado do tubo de silicone sem beliscá-lo. Feche todos os outros brônquios, vasos sanguíneos e lesões com pinças para que nenhuma agarose possa vazar durante o procedimento de preenchimento.

Boas habilidades anatômicas são necessárias para canular o brônquio principal. Os pulmões não devem ser muito expandidos, caso contrário, o tecido irá distrair e, se o tecido não estiver preenchido o suficiente, será impossível fazer qualquer PCLS porque o tecido é muito mole.

Em seguida, misture um volume equivalente de agarose de baixo teor de gel a 3% com meio de cultura em um béquer e instile a mistura no pulmão usando uma seringa de 50 mililitros. Antes de reabastecer a seringa com meio, feche o cateter com os dedos ou com uma pinça para evitar bolhas de ar e fluxo livre de agarose. Corte o tecido pulmonar em placas de 3 a 5 centímetros.

Encha o cortador de lenços de papel com 400 mililitros de EBSS gelado. Imediatamente, corte os núcleos de tecido cilíndrico das placas pulmonares usando uma chave de fenda semiautomatizada com uma ferramenta de retirada do núcleo. Em seguida, transfira os núcleos de tecido para o suporte de tecido do cortador de tecido. Coloque o peso em cima do núcleo do tecido e comece a cortar o núcleo do tecido em PCLS. O meio deve ser drenado do cortador de lenços de papel para um béquer abrindo a braçadeira do cilindro de vidro.

Em seguida, transfira as fatias de um béquer para a placa de Petri com meio de cultura. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma incubadora e deixe o meio aquecer antes das etapas de lavagem. Em seguida, transfira as fatias de pulmão cuidadosamente para uma placa de cultura de 24 poços com um mínimo de 500 microlitros de meio de cultura para duas fatias por poço.