Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
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Pegue uma placa de vários poços contendo fatias de pulmão humanas cortadas com precisão, que mantêm a microarquitetura pulmonar nativa.
Remova a mídia. Adicione concentrações crescentes de agente de teste aos poços e incuba.
Dependendo de seu potencial citotóxico, o agente de teste rompe as membranas celulares, induzindo a morte celular e reduzindo as células viáveis dentro das fatias.
Pós-incubação, remova a mídia. Mergulhe as fatias em meios contendo sal de tetrazólio solúvel em água, ou WST-1, e um reagente de acoplamento de elétrons.
incubar. Em células metabolicamente ativas, o sistema de transporte de elétrons da membrana plasmática transfere elétrons do NADH intracelular para o reagente de acoplamento de elétrons extracelular, reduzindo o corante impermeável à célula WST-1 para formazan estável, amarelo-escuro e solúvel em água.
Após a incubação, agite a placa para distribuir uniformemente o formazan e transfira-o para uma placa de vários poços.
Usando um leitor de microplacas, meça a absorbância do formazan, indicativo da viabilidade do tecido.
Uma diminuição na absorbância do formazan, dependente da concentração do agente de teste, indica viabilidade reduzida do corte do pulmão, confirmando a citotoxicidade do agente de teste.
Para preparar uma mistura principal da solução de trabalho, dilua 25 microlitros do reagente WST-1 e 225 microlitros de meio para cada poço. Em seguida, pipete 250 microlitros da solução de trabalho master-mix de WST-1 para cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Certifique-se de que o PCLS esteja totalmente coberto pelo reagente WST-1 durante a incubação.
Em seguida, coloque a placa em um agitador orbital a 200 rpm e agite cuidadosamente por 30 segundos para garantir uma mistura completa do reagente WST-1. Em seguida, pipete 100 microlitros do sobrenadante de cada poço da placa de 24 poços para uma nova placa de fundo plano de 96 poços em duplicatas. Meça a absorção de cada poço a 450 nanômetros usando um leitor de microplacas e subtraia a absorção a 630 nanômetros de referência daquela a 450 nanômetros.