Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:58 min. • July 8th, 2025
Comece com fatias de pulmão humanas cortadas com precisão, PCLS, tratadas com agentes citotóxicos como moléculas de surfactante em uma placa multipoços.
O surfactante se insere na bicamada lipídica da célula, fazendo com que as caudas hidrofóbicas do surfactante interajam com o núcleo hidrofóbico da bicamada lipídica.
Consequentemente, o arranjo ordenado das moléculas lipídicas é perturbado, levando à formação de uma micela.
Isso compromete a integridade da membrana, causando o vazamento de conteúdo intracelular, incluindo lactato desidrogenase ou LDH, um indicador comum de danos à membrana celular.
Colete o sobrenadante contendo o LDH liberado.
Adicione o coquetel de reação do ensaio LDH contendo substrato de lactato, NAD +, diaforase e sal de tetrazólio e incube.
A LDH oxida o lactato em piruvato, com redução simultânea da coenzima NAD+ a NADH.
A diaforase utiliza o NADH para reduzir o sal de tetrazólio em formazan - um produto colorido.
A citotoxicidade induzida por surfactante pode ser medida a partir da atividade de LDH indicada pela produção de formazan.
Depois de incubar o PCLS com ou sem agentes de teste, transfira 50 microlitros de sobrenadante e duplicatas para uma nova placa de 96 poços. Isso gera duplicatas de cada poço tratado de uma placa de 24 poços.
Imediatamente antes do ensaio, prepare uma mistura principal da solução de trabalho do reagente LDH misturando completamente 125 microlitros de solução catalisadora com 6,25 mililitros de solução de corante para uma placa de 96 poços. Em seguida, pipete 50 microlitros da solução de trabalho master-mix em cada poço que já contém 50 microlitros de sobrenadante e incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente no escuro. Depois, meça a absorção de cada poço a 492 nanômetros usando um leitor de microplacas e subtraia a absorção a 630 nanômetros de referência daquela a 492 nanômetros.