Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:34 min. • July 8th, 2025
Pegue uma lamínula contendo mastócitos - células imunes com grânulos secretores, ou SGs, contendo mediadores inflamatórios.
Adicione anticorpos IgE junto com um repórter fluorescente sensível ao pH e incuba.
Os anticorpos se ligam aos receptores Fc nos mastócitos. Os repórteres são internalizados por pinocitose e os endossomos resultantes se fundem com os SGs.
Remova a mídia. Adicionar um antigénio contendo vários epítopos de ligação à IgE; Coloque a lâmina sob um microscópio de fluorescência e aplique o comprimento de onda de excitação necessário.
O pH ácido dos SGs extingue a fluorescência do repórter.
O antígeno se liga a complexos receptores de IgE na superfície da célula, reticulando-os.
A agregação do receptor mediada por antígeno faz com que os SGs migrem em direção à membrana plasmática.
As proteínas SNARE no plasma e na membrana SG medeiam a fusão da membrana e a descarga da carga SG, denominada exocitose.
O pH mais alto do meio causa alcalinização do SG, induzindo os repórteres a recuperar a fluorescência.
Os SGs de entrada se fundem com os fundidos por membrana. A alcalinização do segundo SG medeia a recuperação de fluorescência, confirmando a exocitose do composto.
Adicione 10 microlitros da suspensão celular a uma lamínula com câmara com meio de cultura suplementado com FITC-dextrano fresco e cultive as células RBL durante a noite. Primeiro, prepare uma solução tampão de Tyrode final de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, prepare um reagente secretagogo 20x no tampão recém-feito.
Dissolva o pó de cloreto de amônio no tampão de Tyrode para criar uma solução de cloreto de amônio de 400 milimolares. Em seguida, aspire o meio da lamínula com câmara e substitua-o por 300 microlitros de tampão de Tyrode pré-aquecido. Depois de repetir o processo de lavagem duas vezes, reabasteça a câmara com 300 microlitros de tampão de Tyrode.
Em seguida, coloque a lamínula com câmara na câmara da incubadora de um microscópio e certifique-se de que a câmara esteja estável. Ligue a fonte de luz fluorescente e selecione o filtro de fluorescência apropriado. Quando a região de interesse estiver em foco no meio do campo de visão, desligue a fonte de luz.
Em seguida, ligue o laser de 488 nanômetros com a emissão reunida em torno de 500 a 550 nanômetros. Em seguida, calibre o intervalo de tempo entre as aquisições de imagem. Defina a direção da digitalização como "Bidirecional". Não permita a média. Abra o orifício e defina a resolução em 512 por 512.
Em seguida, crie imagens das células pela duração apropriada para o tipo de célula ou secretagogo específico. Em seguida, adicione 16 microlitros da solução secretagoga à câmara e continue filmando. Finalmente, para confirmar a presença e localização de FITC-dextrano nos grânulos secretores, adicione suavemente 16 microlitros de solução de cloreto de amônio à câmara.