JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 2:49 min • July 8th, 2025
Pegue um dispositivo de filtro centrífugo de grande volume contendo membranas verticais de celulose regenerada de um tamanho de poro adequado.
Adicione tampão e centrifugue. Remova o umectante de membrana contendo fluxo.
Carregue o dispositivo com proteína filtrada de cultura bacteriana, ou CFP, abrangendo proteínas solúveis e vesículas extracelulares, ou EVs – estruturas nanométricas ligadas a lipídios contendo biomoléculas secretadas por bactérias.
Durante a centrifugação, o CFP passa tangencialmente através das membranas por meio de força centrífuga.
Biomoléculas menores que os poros da membrana passam com o fluido de cultura, enquanto as maiores, como EVs, passam pela superfície da membrana, minimizando o entupimento da membrana.
O filtro concentra o CFP em um volume mínimo do dispositivo, auxiliado por seu volume de parada para evitar a secagem da biomolécula.
Adicione tampão e centrifugue.
O tampão substitui os componentes residuais do meio, criando um ambiente isotônico para as biomoléculas de CFP e mantendo sua integridade.
Coloque o copo de concentrado sobre o copo do filtro, inverta e centrifugue. Recupere o retentado concentrado de CFP para análise posterior.
Para começar, prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kilodalton adicionando a capacidade total de volume de PBS. Centrifugue por cinco minutos a 2.800 vezes g a 4 graus Celsius. Rejeitar o fluxo e o PBS restante e encher a câmara de recolha com Mtb CFP até à sua capacidade máxima. Centrifugue a 2.800 vezes g a 4 graus Celsius até que o volume seja reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração. Repetir se necessário até que toda a amostra tenha sido suficientemente reduzida.
Adicione 1x PBS à unidade de filtro que contém o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume conforme descrito anteriormente e repita esta etapa cinco vezes para garantir a lavagem completa e a troca do tampão. Em seguida, recupere o retentado de CFP concentrado de 100 kilodaltons, ou 100R, de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração. Lave o filtro com um volume mínimo de 1x PBS pelo menos três vezes e puxe a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação.