JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 2:58 min • July 8th, 2025
Comece com larvas de peixe-zebra transgênicas expressando células imunes marcadas com fluorescência marcadas com marcadores fluorescentes exclusivos para rastreamento preciso.
As larvas são pré-injetadas com proteína fluorescente vermelha que expressa esporos de Aspergillus, em seu rombencéfalo.
Dentro do rombencéfalo, os esporos do fungo imitam a inflamação local e atraem células imunológicas, incluindo macrófagos, que fagocitam esporos para sua depuração.
Enquanto alguns esporos persistem e germinam em hifas, liberando moléculas derivadas de patógenos e atraindo neutrófilos para o local da infecção.
Transfira uma larva anestesiada para a câmara de carregamento contendo meio do dispositivo de ferimento e aprisionamento do peixe-zebra para crescimento e imagem, ou zWEDGI, dispositivo interconectado à câmara de ferimento por meio de um canal de restrição.
Prenda a larva dentro do canal de restrição em uma orientação dorsal-lateral para imagens do rombencéfalo.
Nos estágios iniciais, a fluorescência vermelha representa os esporos do fungo, enquanto a fluorescência verde confirma o recrutamento de macrófagos para o local da infecção.
Com o tempo, a disseminação da fluorescência vermelha significa progressão da infecção, enquanto o surgimento de fluorescência azul adicional indica recrutamento de neutrófilos.
No dia da imagem, prepare uma placa de Petri de 3,5 milímetros com PTU 100 micromolar e outra com E3-tricaína. Adicione E3-tricaína nas câmaras de um dispositivo zWEDGI e use uma micropipeta P100 para remover as bolhas de ar das câmaras e do canal de contenção e, em seguida, remova todo o excesso de E3-tricaína fora das câmaras.
Pipete uma larva e transfira-a para o prato com o E3 PTU, em seguida, transfira-a para o E3-tricaine com o mínimo de líquido possível. Após 30 segundos, transfira as larvas anestesiadas para a câmara de carregamento do dispositivo de ferimento e aprisionamento.
Remova a E3-tricaína da câmara de ferimento e solte-a na câmara de carregamento para mover a cauda das larvas para o canal de restrição. Certifique-se de que a larva esteja posicionada em seu lado lateral, dorsal ou dorsolateral para que o rombencéfalo possa ser visualizado com uma lente objetiva invertida.
Depois de obter imagens da larva com um microscópio confocal, libere E3-tricaína na câmara de ferimento para empurrar a larva do canal de contenção para a câmara de carregamento. Pegue a larva e transfira-a de volta para o prato com E3-tricaína e, em seguida, transfira-a para o prato com E3 PTU com o mínimo de líquido possível. Enxágue em PTU e transfira-o de volta para a placa de 48 poços.