Um ensaio de opsonidade para avaliar a opsonização de bactérias encapsuladas por anticorpos anticápsula

Tome uma suspensão de Bacillus anthracis quimicamente morto e marcado com fluorescência.

A cápsula bacteriana, composta principalmente de ácido poli-gama-glutâmico, fornece proteção contra a fagocitose.

Tome soros de primatas não humanos, inativados pelo calor para destruir as proteínas do complemento. Esses soros, isolados de animais imunizados com uma vacina à base de cápsula bacteriana, contêm anticorpos anticápsula.

Adicione a suspensão bacteriana quimicamente morta aos soros. Os anticorpos se ligam especificamente às cápsulas bacterianas, facilitando a opsonização bacteriana e marcando-as para eliminação por células fagocíticas. Adicione proteínas padrão do complemento para melhorar a opsonização.

Transfira as bactérias opsonizadas para macrófagos aderentes - células fagocíticas. Incube brevemente.

Os anticorpos e proteínas do complemento na bactéria se ligam aos receptores Fc e receptores do complemento dos macrófagos, respectivamente, promovendo a adesão bacteriana.

Remova a mídia. Lave com tampão para remover bactérias não aderidas.

Fixe as células para preservar a integridade celular.

Use uma coloração fluorescente para rotular os macrófagos.

Usando um microscópio de fluorescência, observe as bactérias fluorescentes aderidas a macrófagos fluorescentes diferentes, confirmando a opsonização bacteriana eficaz por anticorpos anti-cápsula.

Lave o estoque bacteriano inativado três vezes em PBS para remover o fixador. Adicionar a solução de FITC a uma concentração final de 75 microgramas por mililitro. Lentamente, agite a mistura por 18 a 24 horas a quatro graus Celsius. Lave as bactérias como antes para remover o excesso de FITC.

Após a lavagem final, ressuspender os bacilos em PBS no mesmo volume inicial. Alíquota e armazenar bacilos em -20 graus Celsius até o uso. Inativar pelo calor um pequeno volume de soros de teste de primatas não humanos a 56 graus Celsius por 30 minutos, em um bloco de calor ou máquina de PCR. Descongele e lave as bactérias marcadas com FITC com PBS duas vezes, peletizando a 15.000 vezes g por três a cinco minutos. Ressuspenda no PBS no mesmo volume inicial.

Numa placa de fundo redondo de 96 poços, diluir em série os soros de ensaio em meio celular. Em outra placa de fundo redondo de 96 poços, adicione 10 microlitros de soros de teste diluídos em cada poço. Em seguida, adicione 10 microlitros de complemento de coelho bebê recém-reconstituído.

Na placa número três, adicione o volume apropriado de bacilos marcados com FITC para uma multiplicidade de infecção de 20, por exemplo, em um volume contendo 50.000 vezes 20 bacilos para 50.000 células. Complete cada poço na placa número três com o volume apropriado de meio celular até um total de 105 microlitros. Incubar a placa número três a 37 graus Celsius por 30 minutos na presença de 5% de CO2 com umidade para opsonizar bacilos.

Coloque a placa número um que contém células aderentes em um bloco de calor de 37 graus Celsius. Use um pipetador multicanal para remover o meio gasto dos poços e substitua rapidamente por 100 microlitros de bactérias opsonizadas da placa número três, garantindo que nenhuma bolha seja gerada nos poços durante a pipetagem. Para não perturbar a monocamada da célula, adicione volume às laterais dos poços.

Incube a placa número um a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ e umidade por 30 minutos para aderência. Lave cada poço cinco vezes com 150 microlitros de PBS em cima de um bloco de calor de 37 graus Celsius para remover bacilos soltos. Pipete para o lado dos poços para garantir que as células não sejam dispersas acidentalmente durante a lavagem. Adicione 150 microlitros de paraformaldeído a 4% em cada poço e fixe as células por uma hora.

Depois de lavar as células duas vezes com PBS, misture dois microlitros de coloração de células laranja de triagem de alto conteúdo em 10 mililitros de PBS. Em seguida, adicione 150 microlitros desta solução de coloração às células fixas e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Coloque a placa número um no palco e concentre-se nas células usando campo claro ou contraste de fase.

Na guia Aquisição, selecione Formato de 96 poços como a configuração da placa e, em seguida, selecione Configurações do canal. Em seguida, selecione Configuração para o modo lado a lado. Indique o número de imagens a serem adquiridas. Altere o modo de aquisição para preto e branco ou monocromático e defina o compartimentalização para pelo menos 2 por 2. Ligue o foco automático ou o módulo de foco. Indique com que frequência a função de focagem automática deve ser executada.

Em seguida, ative a função z-stack, se disponível, indique o número de z-stacks que capturarão a espessura da monocamada celular e dos bacilos aderentes. Designe uma pasta de arquivos para salvar as imagens. Agora, execute o programa de imagem automatizado. Realizar a coleta e análise de dados, conforme descrito no protocolo de texto.