Avaliação da ativação controlada de células T com um peptídeo fotoativável MHC

Comece revestindo uma lamínula com poli-L-lisina biotinilada para criar uma superfície rica em biotina.

Em seguida, introduza a estreptavidina - uma proteína que se liga à biotina, formando uma ponte molecular para interações subsequentes.

Em seguida, adicione peptídeos fotocaged biotinilados ligados aos principais complexos de histocompatibilidade - pMHCs junto com moléculas de adesão.

Os ligantes pMHC biotinilados e as moléculas de adesão interagem com regiões específicas da estreptavidina, permitindo sua imobilização.

Em seguida, lave a lamínula com solução salina tamponada repetidamente e introduza células T.

A presença de uma fotogaiola, um grupo químico sensível à luz ligado a um resíduo específico no peptídeo, obstrui a ligação espontânea do receptor de células T ao peptídeo.

Para ativação controlada de células T, exponha os peptídeos fotoenjaulados à luz ultravioleta.

A luz UV quebra a ligação química entre o complexo fotogaiola-peptídeo, expondo a forma nativa do peptídeo.

Os receptores de células T identificam e se ligam aos peptídeos expostos, enquanto as integrinas se ligam às moléculas de adesão, desencadeando a ativação das células T.

Comece adicionando poli-L-lisina biotinilada ou bio-PLL diluída de 1 a 500 em água destilada deionizada a 8 vidros de cobertura com câmara de 8 poços. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, lave com água destilada deionizada e seque por duas horas em temperatura ambiente.

Bloqueie as superfícies revestidas com bio-PLL com tampão de bloqueio consistindo de solução salina tamponada com HEPES com 2% de BSA por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio das superfícies revestidas com bio-PLL sem permitir que os alvéolos sequem. Em seguida, adicione estreptavidina e incube a 4 graus Celsius.

Após uma hora, lave as superfícies revestidas em HBS. Encha e inverta os poços de deslizamento da câmara 4 a 5 vezes, removendo o HBS dos poços. Não deixe os poços secarem.

Adicione o peptídeo fotoativável biotinilado específico, os principais ligantes do complexo de histocompatibilidade e as moléculas de adesão para células T CD4-positivas ou células CD8-positivas às superfícies revestidas com bio-PLL. Proteja da luz e incube por 1 hora em temperatura ambiente. Após a incubação, lave como antes e deixe em HBS até que esteja pronto para semear. Finalmente, adicione 200.000 células T CD4-positivas ou CD8-positivas, expressando o TCR apropriado nos poços corretos, e deixe as células aderirem a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Uma vez que as células se ligam e se espalham na superfície, elas estão prontas para fotoativação e imagem. Use um microscópio de fluorescência de reflexão interna total invertida equipado com uma lente objetiva de 150x compatível com UV para aquisição de imagens. Monitore as sondas nos canais verde e vermelho usando lasers de excitação de 488 nanômetros e 561 nanômetros, respectivamente.

Depois de montar a lâmina da câmara contendo as células T, ajuste as configurações do microscópio para obter TIRF ou iluminação de epifluorescência conforme necessário. No modo ao vivo, selecione um campo de células que estão expressando as sondas fluorescentes de interesse. Estabeleça regiões em escala de mícron para fotoativação sob células individuais usando o controle de software. Em seguida, inicie a aquisição.

Normalmente, 80 pontos de tempo são adquiridos com um intervalo de 5 segundos entre cada um. Isso deixa tempo para exposições sequenciais de 488 nanômetros e 563 nanômetros no caso de experimentos de duas cores. Em seguida, depois de adquirir 10 pontos de tempo, fotoative as regiões selecionadas abrindo o obturador digital do diafragma por 1 a 1.5 segundos. Após a conclusão do lapso de tempo, selecione um novo campo de células e repita o processo.