Um método de localização de imunofluorescência in vivo para estudar a biodistribuição de anticorpos

Pegue um modelo murino de câncer de mama. Os tumores da glândula mamária compreendem células cancerígenas, fibroblastos associados ao câncer, adipócitos, células imunes e vasculatura tumoral.

Injete por via intravenosa anticorpos específicos do tumor conjugados com fluoróforo.

Ao atingir a vasculatura tumoral, os anticorpos se ligam a proteínas transmembranares específicas do tumor no endotélio do vaso e nas células cancerígenas próximas.

Isole cirurgicamente a glândula mamária e mergulhe-a em um meio de congelamento.

Obtenha seções criogênicas em uma lâmina e enxágue com um tampão para remover o meio de congelamento.

Fixe as seções para preservar a arquitetura do tecido. Aplique um detergente para melhorar a imunocoloração e uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Introduza um anticorpo primário específico para moléculas de adesão no endotélio do vaso sanguíneo e um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo que se liga ao anticorpo primário, marcando a vasculatura.

Adicione um meio de montagem no slide e coloque uma lamínula.

Sob um microscópio confocal, avalie a biodistribuição de anticorpos específicos do tumor dentro e ao redor da vasculatura tumoral marcada com fluorescência.

Após a anestesia conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para a inoculação da veia da cauda das soluções de anticorpos. Desinfete a cauda do animal limpando três vezes com um lenço umedecido com álcool. Dilate as veias da cauda aquecendo com uma almofada térmica por aproximadamente 30 segundos; Evite aquecer o animal inteiro. Usando um cateter de palheta caudal de calibre 27, insira a agulha borboleta em uma das duas veias laterais da cauda.

Visualize o refluxo sanguíneo para o cateter para garantir que a agulha seja colocada corretamente para que as soluções entrem totalmente no animal em vez de serem capturadas na cauda.

Use um pedaço de fita cirúrgica para fixar cuidadosamente a cauda com a agulha inserida no palco. Lave o cateter com 25 microlitros de solução salina estéril tamponada com fosfato. Em seguida, injete a solução de anticorpos no cateter usando seringas de insulina. Lave o cateter mais uma vez com 25 microlitros de PBS estéril. Remova a agulha da cauda e aplique pressão para estancar qualquer sangramento.

Realize a eutanásia humana do camundongo, conforme descrito no protocolo de texto, e coloque o mouse em decúbito dorsal. Use tesouras cirúrgicas e fórceps para extirpar tecidos tumorais. Use uma pinça para agarrar apenas a camada externa da pele entre o conjunto de glândulas mamárias mais próximas da cauda e fazer uma pequena incisão com uma tesoura cirúrgica. Introduza a tesoura fechada no corte e abra lentamente a ponta para separar cuidadosamente a pele da membrana da parede abdominal subjacente, mantendo-a intacta.

Faça uma incisão vertical no abdômen, continuando a separar a pele da membrana interna. Entre a terceira e a quarta glândulas mamárias, faça um corte horizontal no abdômen, para permitir a retração da pele e a visualização das glândulas mamárias. Agarrando cada tumor ou glândula normal com uma pinça, corte cuidadosamente a pele anexada usando uma tesoura cirúrgica.

Coloque os lenços excisados em moldes de base descartáveis de tecido que são pré-rotulados e preenchidos com meio de incorporação de temperatura de corte ideal. Congele rapidamente os moldes colocando-os em gelo seco. Para estudar a entrega fora do alvo, excise outros tecidos ou órgãos de interesse. Usando um criostato, corte blocos de tecido congelado com espessura de 10 mícrons e coloque as seções adjacentes em lâminas de vidro de adesão pré-rotuladas.

Enxágue as lâminas de tecido congeladas com PBS em temperatura ambiente por 5 minutos para remover o meio de inclusão. Demarque as seções de tecido com uma caneta barreira hidrofóbica para reduzir o volume de soluções necessárias durante a coloração. Fixe as seções de tecido com solução de paraformaldeído a 4% por 5 minutos. Depois de enxaguar as lâminas em PBS por 5 minutos, permeabilize as seções de tecido com 0,5% de Triton X-100 em PBS por 15 minutos. Enxágue as lâminas novamente em PBS por 5 minutos.

Bloqueie os tecidos com PBS contendo 3% de peso por volume de albumina de soro bovino e 5% de volume por volume de soro de cabra por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de enxaguar as lâminas em PBS por 5 minutos, incube as seções com anticorpos primários de manutenção de registros, como um marcador nuclear, vascular ou citoplasmático comum. Aqui, o CD31 anti-camundongo de rato é usado em uma diluição de 1 a 100 na solução de bloqueio. As lâminas com anticorpo primário são deixadas durante a noite a 4 graus Celsius, protegidas da desidratação em uma bandeja de lâminas.

Após a incubação, enxágue as lâminas em PBS por 5 minutos três vezes. Troque o PBS a cada vez. Incube as lâminas com anticorpos secundários para rotular os anticorpos primários. Para esta aplicação, visualize o anticorpo anti-B7-H3 usando o anticorpo anti-coelho de cabra conjugado AlexaFluor-546 e visualize o CD31 com o anticorpo secundário anti-rato de cabra AlexaFluor-488 em solução de bloqueio. Proteja as lâminas da luz e da desidratação em uma bandeja de lâminas por 1 hora em temperatura ambiente.

Depois de enxaguar as lâminas em PBS, como antes, aplique uma gota do meio de montagem no centro da fatia de tecido. Coloque cuidadosamente uma lamínula evitando o aprisionamento de bolhas de ar. Sele as bordas da lamínula com esmalte transparente e deixe secar. Prossiga com a imagem de microscopia confocal e análise quantitativa de imagem, conforme descrito no protocolo de texto.