Um imunoensaio multiplex baseado em esferas para identificar anticorpos específicos de patógenos na saliva

0 views • 3:45 min • July 8th, 2025

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Pegue uma mistura de diferentes conjuntos de microesferas - ou contas de poliestireno do tamanho de mícrons.

Cada conjunto é acoplado a um antígeno exclusivo de um patógeno ambiental e é marcado exclusivamente com fluorescência.

Adicione a mistura a uma placa filtrante contendo uma membrana na parte inferior.

Introduzir saliva humana contendo anticorpos contra patógenos ambientais, que se ligam a antígenos cognatos nas microesferas.

Remova os anticorpos não ligados por vácuo. Os anticorpos ligados à microesfera são retidos devido ao pequeno tamanho dos poros da membrana.

Adicione anticorpos secundários biotinilados para se ligar aos anticorpos ligados à microesfera. Remova os anticorpos não ligados.

Adicione estreptavidina conjugada a um corante repórter fluorescente, que se liga à biotina nos anticorpos secundários.

Remova o corante não ligado, ressuspenda as microesferas e passe-as por um analisador de imunoensaio multiplex.

Um feixe de laser detecta a fluorescência da microesfera, identificando o antígeno, enquanto outro feixe detecta o sinal do repórter, confirmando um anticorpo ligado.

Anticorpos específicos do antígeno na saliva indicam exposição prévia aos patógenos correspondentes.

Depois de ressuspender os estoques de grânulos acoplados ao antígeno por vórtice e sonicação por 20 segundos, dilua os estoques de grânulos acoplados até uma concentração final de 100 grânulos por microlitro de cada conjunto de grânulos exclusivo em PBS mais BSA. Em seguida, prepare uma diluição de 1 a 4 de saliva em temperatura ambiente em PBS mais BSA em uma placa de poço de 96 poços de profundidade. Umedeça previamente uma placa de filtro com 100 microlitros de tampão de lavagem e aspire o sobrenadante.

Em seguida, adicione 50 microlitros de grânulos acoplados a antígenos e um volume igual de saliva diluída a 95 poços da placa de filtro de 96 poços para uma diluição final de um a oito. Ao mesmo tempo, adicione 50 microlitros de grânulos acoplados a antígenos mais 50 microlitros de PBS mais BSA sozinho ao poço de controle.

Incube as esferas no escuro à temperatura ambiente por uma hora no agitador de microplacas a 500 RPM. Em seguida, aspire o sobrenadante e lave os poços duas vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem. Após a segunda lavagem, ressuspenda as esferas em 50 microlitros de PBS mais BSA, dilua o anticorpo secundário e adicione 50 microlitros a cada poço.

Depois de misturar o conteúdo do poço com uma pipeta multicanal, incube a placa no agitador no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços duas vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem e ressuspenda os grânulos em 50 microlitros de PBS fresco mais BSA.

Agora, dilua o repórter e adicione 50 microlitros a cada poço. Misture bem com a pipeta multicanal. Após 30 minutos à temperatura ambiente no agitador no escuro, lave os poços duas vezes conforme demonstrado. Em seguida, ressuspenda as esferas em 100 microlitros de PBS mais BSA e avalie as amostras no analisador.

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Grânulo baseado Multiplex ensaio para análise de perfis de citocinas lágrima

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Last updated: 18 July 2026