Medição Quantitativa por Citometria de Fluxo de Fagocitose de Esporos Fúngicos por Fagócitos Humanos

Pegue uma placa de vários poços contendo uma suspensão de leucócitos humanos. Adicione esporos de fungos patogênicos marcados com FITC.

Durante a incubação, os esporos incham e quebram sua rígida camada de proteína hidrofóbica, expondo os polissacarídeos da parede celular reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões específicos nas células fagocíticas.

Essa ligação desencadeia vias de sinalização intracelular, levando ao rearranjo da actina e à internalização dos esporos nos fagossomos.

Dependendo do estado de ativação dos fagócitos, alguns esporos permanecem aderidos às células sem internalização.

Após a incubação, colha as células e transfira-as para um novo tubo.

centrifuga. Ressuspenda as células em um tampão e transfira-as para uma placa de fundo em V de vários poços.

Introduza anticorpos anti-FITC marcados com fluoróforo que se ligam às moléculas FITC expostas nos esporos aderentes, contracolorindo-os.

centrifuga. Ressuspenda as células em um tampão e transfira-as para tubos de citômetro de fluxo.

Realize citometria de fluxo para diferenciar entre esporos internalizados e aderentes à célula.

Os fagócitos contendo esporos internalizados exibem sinais FITC, enquanto as células com esporos aderentes exibem sinais FITC e de contracoloração.

Para começar, transfira 2 milhões de leucócitos e 4 milhões de conídios marcados com FITC em 1,5 mililitros de RPMI suplementado com 10% de FCS para uma placa de cultura de 12 poços. Inclua um controle de células apenas sem conídios e um controle de células com conídios não marcados. Incube a placa em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado a 37 graus centígrados pelo tempo desejado. Quando a incubação estiver concluída, use um raspador de células para colher as células e transferi-las para um tubo de 15 mililitros.

Primeiro, coloque 100 microlitros de cada amostra e controle em um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços. Adicione 150 microlitros de PBS contendo 2 milimolares de EDTA para lavar. Para compensação de cor, coloque 1 milhão de células sem conídios para cada cor em outros poços da placa. Inclua um poço de células que serão deixadas sem tensão. Adicione 150 microlitros de PBS contendo 2 milimolares de EDTA a cada poço para lavagem.

Em seguida, cubra a placa com uma folha adesiva e centrifugue a 300 vezes g em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, remova o papel alumínio e descarte o sobrenadante invertendo a placa com rapidez e força apenas uma vez sobre a pia ou uma toalha de papel descartável. Ressuspenda as células em 100 microlitros de mistura de anticorpos e misture bem por pipetagem.

Para compensação de cor, ressuspenda as respectivas células em 100 microlitros de PBS contendo 2 milimolares de EDTA e adicione um único tipo de anticorpo a cada poço na mesma quantidade usada na mistura de anticorpos. Cubra com uma folha adesiva e incube em temperatura ambiente no escuro por 20 minutos.

Depois disso, remova o papel alumínio e adicione 150 microlitros de PBS contendo 2 milimolares de EDTA a cada poço para lavagem. Cubra o prato com papel alumínio novamente. Centrifugue a 300 vezes g e à temperatura ambiente durante cinco minutos, retire a folha de alumínio e elimine o sobrenadante invertendo rápida e vigorosamente a placa sobre um lavatório ou uma toalha de papel descartável. Ressuspenda as células em 200 microlitros de PBS contendo 2 EDTA milimolares e transfira a suspensão celular de cada poço para um tubo de fundo redondo separado.

Ligue o citômetro de fluxo e deixe-o aquecer. No software de aquisição, crie um novo experimento e configure e rotule as novas amostras. Configure os parâmetros e os detectores para os fluoróforos apropriados, conforme descrito no protocolo de texto.

Neste software, exiba os gráficos de pontos apropriados conforme descrito no protocolo de texto. Usando a amostra somente de células, adquira algumas células e defina a porta ao redor dos leucócitos. Com base na porta leucocitária, porta para células positivas para CD45 se separarem dos conídios no gráfico SSC / CD45. Em um gráfico de pontos CD14 / CD66b, bloqueie neutrófilos e monócitos separadamente.

Depois disso, mude da amostra somente de células para conídios não marcados. Em um gráfico de pontos, o anti-FITC/FITC exibe neutrófilos e define quadrantes para sinais anti-FITC e FITC. Abra a visualização de estatísticas e ajuste os quadrantes, permitindo um máximo de 1% de células nos quadrantes Q1, Q2 e Q4.

Repita este processo para a porta do monócito. No portão leucocitário, registre todas as amostras com pelo menos 20.000 eventos. A fagocitose de conídios marcados com FITC por neutrófilos humanos pode ser lida nas visualizações estatísticas.