Um ensaio de imunofluorescência para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos

Pegue uma placa de vários poços contendo células de osteossarcoma aderentes em lamínulas.

Essas células cancerígenas ósseas são pré-tratadas com um produto químico indutor de estresse, resultando na formação de grânulos de estresse.

Os grânulos de estresse são organelas sem membrana citoplasmática que compreendem mRNAs não traduzíveis, pequenas subunidades ribossômicas, proteínas de ligação a RNA ou RBPs, fatores relacionados à tradução e proteínas de sinalização.

Descarte a mídia e lave as células com tampão. Fixe as células para preservar a morfologia celular.

Permeabilize as células para acessar alvos intracelulares. Adicione proteínas bloqueadoras para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Introduzir anticorpos primários que se ligam a RBPs específicos e fatores relacionados à tradução dentro dos grânulos de estresse.

Incubar com diferentes anticorpos secundários marcados com fluoróforo e corante Hoechst.

Os anticorpos secundários se ligam aos anticorpos primários ligados às proteínas associadas ao grânulo de estresse, enquanto as moléculas de Hoechst coram o DNA.

Monte as lamínulas contendo células usando a mídia de montagem.

Usando um microscópio de fluorescência, observe as células para visualizar e quantificar os grânulos de estresse, que aparecem como focos fluorescentes caracterizados pela co-localização de proteínas associadas.

Para fixar as células, remova o meio dos poços e lave as células com aproximadamente 250 microlitros de PBS. Adicione aproximadamente 250 microlitros de uma solução tamponada de paraformaldeído a 4% para fixar as células, certificando-se de que a parte superior da lamínula esteja completamente coberta. Em seguida, deixe o prato em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, remova e descarte adequadamente o paraformaldeído.

Adicione aproximadamente 250 microlitros de metanol gelado para permeabilizar e achatar as células. Incube a placa por mais 5 minutos em temperatura ambiente em um balancim. Quando a permeabilização estiver completa, descarte o metanol e bloqueie as células aplicando aproximadamente 250 microlitros de um tampão bloqueador por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a solução de anticorpo primário adicionando 12 microlitros de anticorpos contra G3BP1, eIF4G e eIF3b a 3 mililitros de tampão de bloqueio.

Adicione 250 microlitros da solução de anticorpos a cada poço da placa de 24 poços. Incube a placa em um balancim por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Após 1 hora de incubação, remova a solução de anticorpos e lave as células com aproximadamente 250 microlitros de PBS por 5 minutos. Em seguida, adicione 12 microlitros de anticorpos anti-camundongo Cy2, anti-coelho Cy3 e anti-cabra Cy5 junto com 3 microlitros de corante Hoechst a 3 mililitros de tampão de bloqueio para preparar a solução de anticorpo secundário.

Adicione 250 microlitros da solução de anticorpo secundário a cada poço e cubra a placa para proteger as amostras da luz. Incube a placa em um balancim em temperatura ambiente por 1 hora. Quando a incubação estiver concluída, remova a solução de anticorpos e lave as células com PBS por 5 minutos. Aqueça o meio de montagem no bloco de calor de 37 graus Celsius por 10 minutos para reduzir a viscosidade. Em seguida, usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros pré-cortada, coloque 25 microlitros do meio de montagem em uma lâmina de vidro rotulada.

Com uma pinça fina, transfira a lamínula do poço para a lâmina, invertendo a parte superior para que as células fiquem voltadas para o meio de montagem. Use uma ponta P200 limpa para pressionar a lamínula para baixo. Depois que todas as lamínulas estiverem montadas, remova o excesso de meio de montagem pressionando um lenço de papel firmemente contra a lâmina. Depois, lave a lâmina com água e seque-a imediatamente com tecido de laboratório novamente.