Um ensaio para avaliar a fagocitose e a atividade de explosão oxidativa em granulócitos e monócitos

Comece com tubos contendo sangue total humano, incluindo glóbulos vermelhos, ou hemácias, e glóbulos brancos, ou leucócitos, como monócitos e granulócitos, e outras células sanguíneas.

Introduza dihidroetídio - um indicador de superóxido e bactérias não marcadas em um tubo. Trate o outro tubo com bactérias marcadas com fluoróforo verde.

Granulócitos e monócitos interagem com as moléculas associadas a patógenos da bactéria, envolvendo-as em fagossomos.

Isso ativa a enzima de membrana fagossomal NADPH oxidase, reduzindo o oxigênio molecular a um ânion superóxido.

O ânion superóxido produz ainda peróxido de hidrogênio - uma espécie de oxigênio reativo, ou ROS, resultando em uma explosão oxidativa.

Dentro do fagossomo, as ROS oxidam o diidroetídio para formar 2-hidroxietídio, que cora o DNA bacteriano, conferindo uma fluorescência vermelha.

Introduza um supressor, para extinguir a fluorescência extracelular.

Adicione uma solução de lisagem, eliminando a interferência potencial de hemácias, e corrija os leucócitos.

Na citometria de fluxo, as células com fluorescência verde confirmam a atividade fagocítica dos granulócitos e monócitos, enquanto as células com fluorescência vermelha em outro tubo indicam atividade de explosão de oxigênio nessas células.

Antes de iniciar o procedimento, use um analisador hematológico para realizar um hemograma completo com análise diferencial de glóbulos brancos nas amostras de sangue, de acordo com as instruções do fabricante. Anote a contagem de glóbulos brancos em células por mililitro e os valores percentuais de neutrófilos e monócitos para as amostras.

Em seguida, para cada tubo experimental e de controle, use uma ponta de pipeta de comprimento estendido para transferir 100 microlitros de cada amostra de sangue total do tubo de coleta de sangue de heparina de lítio para o fundo de um tubo de 12 por 75 milímetros devidamente rotulado. Quando todo o sangue tiver sido transferido, adicione 10 microlitros da solução de trabalho HE aos tubos marcados com tinta vermelha e um H, incluindo o tubo de controle HE, e tampe os tubos.

Vortex as amostras brevemente e transfira os tubos para um banho-maria de 37 graus Celsius em uma prateleira de metal aberta com agitação suave a cada cinco minutos. Após 15 minutos, transfira rapidamente o rack e os tubos para um banho de água gelada por 12 minutos, agitando suavemente a cada cinco minutos.

No final da incubação, adicione o volume apropriado de solução de trabalho de S aureus não marcada aos tubos marcados com tinta vermelha e um H, incluindo o tubo de controle HE. Vortex os tubos brevemente com as tampas. Em seguida, adicione o volume apropriado de solução de trabalho de S aureus marcada com FITC aos tubos marcados com tinta preta e um F, incluindo o tubo de controle FITC, e faça um vórtice breve das amostras.

Em seguida, incube todos os tubos no banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos com agitação a cada cinco minutos, seguido de um resfriamento de 1 minuto na água gelada. Depois de colocar as amostras em temperatura ambiente, use uma pipeta repetidora para adicionar 100 microlitros de solução de têmpera gelada a todos os tubos e vortex as amostras.

Retorne as amostras para o banho de gelo. Após um minuto, use a pipeta repetidora para adicionar um mililitro de PBS gelado a cada um dos tubos. Em seguida, faça um vórtice nos tubos e adicione mais dois mililitros de PBS às amostras.

Agora, centrifugue as células e aspire o sobrenadante. Usando a pipeta repetidora, adicione 50 microlitros de FBS gelado aos tubos. Após o vórtice, transfira todos os tubos para um carrossel. Use uma estação de trabalho automatizada de preparação de lise celular para lisar os glóbulos vermelhos e fixe os glóbulos brancos de acordo com as instruções do fabricante.