Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:55 min. • July 8th, 2025
Descongele os papéis de filtro contendo o fluido de revestimento da mucosa nasal absorvido no gelo para evitar a degradação da amostra.
O fluido compreende mediadores imunológicos, incluindo quimiocinas e citocinas.
Mergulhe os papéis de filtro em um tampão. Transfira o conteúdo para filtros de tubo. Centrifugue para eluir o fluido de revestimento da mucosa do papel de filtro.
Adicione o extrato nasal filtrado à placa de ensaio padronizada com uma série de anticorpos de captura específicos do mediador.
Os mediadores imunológicos se ligam aos seus anticorpos correspondentes.
Introduzir anticorpos de detecção marcados com um complexo de rutênio, que se ligam aos seus respectivos mediadores.
Adicione tampão à base de tris contendo tripropilamina ou TPA.
Quando um potencial é aplicado através dos eletrodos, o complexo de rutênio e o TPA sofrem oxidação.
O radical TPA resultante excita o complexo de rutênio.
Ao retornar ao seu estado fundamental, o complexo de rutênio emite fótons.
A intensidade da luz medida é proporcional à concentração específica do mediador imunológico no fluido de revestimento da mucosa.
Para quantificação do mediador imunológico das vias aéreas, coloque até 10 amostras de armazenamento negativo de 80 graus Celsius no gelo e registre seus números de identificação. Quando as amostras tiverem descongelado, mergulhe ambos os papéis de filtro por indivíduo em 150 microlitros de tampão recém-preparado por papel de filtro.
Suplemente-o com um comprimido completo de inibidor de protease por 25 mililitros de solução de estoque tampão. Transfira as amostras para um agitador de placas a 400 RPM por 5 minutos. Transfira os papéis tampão e de filtro para os copos de filtros individuais de tubos de acetato de celulose.
Centrifugue as amostras para coletar o extrato nasal filtrado no fundo dos tubos de microcentrífuga. Em seguida, remova os copos e coloque os tubos no gelo. Em seguida, transfira alíquotas de 150 microlitros do extrato nasal para poços individuais de placas de armazenamento de baixa ligação a proteínas e armazene as placas a 80 graus Celsius negativos até a análise. Em seguida, meça a concentração dos mediadores imunes nasais de interesse por meio de matriz multiplexada baseada em eletroquimioluminescência de alta sensibilidade, de acordo com os protocolos de ensaio padrão.