Um ensaio para quantificar a fagocitose mediada por anticorpos de eritrócitos infectados por parasitas

Pegue os eritrócitos infectados com Plasmodium falciparum. Rotule o DNA do parasita com um corante fluorescente para visualização do parasita.

Incube esses eritrócitos infectados por parasitas com soros de indivíduos expostos à malária. Essas células exibem antígenos do parasita em sua superfície, que se ligam a anticorpos IgG humanos adquiridos naturalmente nos soros, opsonizando as células para fagocitose.

Transfira os eritrócitos infectados por parasitas opsonizados para uma placa de vários poços revestida de proteínas contendo uma suspensão de monócitos derivados de humanos - ou células fagocíticas.

Durante a incubação, os receptores Fc-gama nos monócitos interagem com os eritrócitos opsonizados por IgG, desencadeando o engolfamento dos eritrócitos em fagossomos.

Após a incubação, centrifugue a placa para evitar novas interações celulares e interromper a fagocitose.

Descarte o sobrenadante. Tratar com solução de lise de cloreto de amónio, rompendo selectivamente os eritrócitos infetados não fagocitados sem afectar os monócitos.

Adicione tampão contendo soro para interromper o processo de lisagem. Centrifugar e rejeitar o sobrenadante que contém eritrócitos lisados.

Ressuspenda os monócitos em um tampão.

Realize citometria de fluxo para quantificar monócitos que exibem fluorescência dos eritrócitos infectados por parasitas dentro deles, confirmando sua fagocitose mediada por anticorpos.

Ajustar a suspensão purificada de eritrócitos infectados em 3,3 vezes 10 elevado à 7ª célula por mililitro em meio de cultura de parasitas contendo brometo de etídio até uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro. Em seguida, remova a solução de bloqueio de uma placa de 96 poços, sacudindo a placa em um recipiente de resíduos. Em seguida, remova o excesso sobre uma toalha de papel e adicione 30 microlitros da suspensão de eritrócitos infectados com rótulo de brometo de etídio a todos, exceto um poço na metade superior da placa. Adicione 30 microlitros de meio de cultura de parasitas ao poço vazio e incube a placa por 10 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz.

No final da incubação, adicione 170 microlitros de meio de cultura do parasita a cada poço e sedimente os eritrócitos infectados no fundo da placa por centrifugação. Remova o sobrenadante jogando a placa em um recipiente de lixo e lave os eritrócitos infectados marcados com brometo de etídio mais duas vezes com 200 microlitros de meio de cultura de parasitas por poço, como acabamos de demonstrar.

Após a segunda lavagem, use uma pipeta multicanal para remover cuidadosamente todo o volume de sobrenadante de cada poço, sem perturbar os pellets, e ressuspenda os eritrócitos infectados marcados com brometo de etídio em 30 microlitros de solução de anticorpos, incluindo os controles apropriados e amostras de teste previamente preparadas em meio de cultura de parasitas. Em seguida, coloque a placa a 37 graus Celsius por 45 minutos, protegida da luz.

Enquanto os eritrócitos infectados estão sendo opsonizados, colete as células THP-1 por centrifugação e ressuspenda o pellet em 12 mililitros de meio de cultura de células THP-1 fresco pré-aquecido.

Após uma segunda centrifugação, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de meio de cultura de células THP-1 para contagem e ajuste a concentração de células para 5 vezes 10 elevado a 5 células por mililitro em meio de cultura de células THP-1. Remova a solução de bloqueio da segunda placa de 96 poços e adicione 100 microlitros de células THP-1 a cada poço. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células.

No final da incubação de opsonização, adicione 170 microlitros de meio de cultura do parasita a cada poço da placa de opsonização e sedimente os eritrócitos infectados no fundo da placa por centrifugação. Lave os eritrócitos infectados opsonizados duas vezes com 200 microlitros de meio de cultura do parasita por poço usando uma pipeta multicanal para remover cuidadosamente o sobrenadante após a segunda lavagem.

Ressuspenda os eritrócitos infectados opsonizados em 100 microlitros de meio de cultura de células THP-1 pré-aquecido por poço e transfira 50 microlitros de cada suspensão de eritrócitos infectados opsonizados para um poço correspondente na placa de fagocitose. Quando todas as células tiverem sido adicionadas, coloque a placa na incubadora de cultura de células por no máximo 40 minutos, protegida da luz.

No final da incubação, pare a fagocitose por centrifugação a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets com 150 microlitros de solução de lise de cloreto de amônio em temperatura ambiente por poço. Após exatamente três minutos, adicione 100 microlitros de 2% de FBS gelado em PBS para interromper a lise e sedimentar as células intactas por centrifugação.

Em seguida, lave as células três vezes com 200 microlitros de FBS fresco gelado a 2% em PBS, por poço, por lavagem. Após a lavagem final, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de FBS fresco a 2% em PBS por poço.

Para aquisição e análise de citometria de fluxo, carregue imediatamente as células em um citômetro de fluxo e use o gráfico de dispersão lateral linear direta versus linear para os poços sem eritrócitos infectados para bloquear as células THP-1. Adquira 10.000 eventos nesta porta e use as células THP-1 com os eritrócitos infectados opsonizados com um controle positivo para configurar um gráfico de histograma para medir a intensidade de fluorescência do brometo de etídio.

Para análise, abra o gráfico de dispersão lateral linear direta versus linear para os poços sem eritrócitos infectados e bloqueie as células THP-1. Em seguida, configure uma porta positiva em um histograma FL3 e copie essas portas em todos os outros poços de amostra para determinar a porcentagem de células THP-1 positivas para brometo de etídio.