Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:59 min. • July 8th, 2025
Pegue uma microplaca contendo proteases de serina neutrófila ou NSPs. Essas enzimas solúveis com atividade proteolítica, secretadas por neutrófilos, funcionam nas respostas inflamatórias.
Adicione sondas repórteres fluorescentes carregando um motivo de reconhecimento que atua como um local de clivagem para NSPs. As sondas são conjugadas a um doador e a um fluoróforo aceitador.
Após a excitação por um comprimento de onda específico, o fluoróforo doador emite energia. Devido à sua proximidade com o doador, o fluoróforo aceitador absorve a energia e emite fluorescência de um comprimento de onda diferente.
Detecte os sinais do doador e do aceitador separadamente e calcule a proporção doador-aceitador para avaliar a atividade do NSP. Uma proporção baixa indica extinção da fluorescência do doador na ausência de clivagem da sonda.
Os NSPs reconhecem e clivam o motivo de reconhecimento nas sondas, liberando o aceitador.
A distância do aceptor permite a emissão de fluorescência do fluoróforo doador, aumentando a proporção doador-aceitador. Uma alta proporção indica clivagem eficiente da sonda pelos NSPs.
Descongele as enzimas no gelo e estabeleça uma curva padrão de enzimas, conforme descrito no manuscrito do texto. Paralelamente à preparação padrão, diluir as amostras de escarro em tampão de ativação. No leitor de placas, defina o comprimento de onda de excitação para a sonda NE FRET NEmo-1 para 354 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 400 nanômetros para doador e 490 nanômetros para aceptor.
Para a sonda CG FRET sSAM, defina o comprimento de onda de excitação para 405 nanômetros e a emissão para 485 nanômetros para doador e 580 nanômetros para o aceitador. Adicione 40 microlitros de amostras, padrões ou espaços em branco nos poços de uma placa preta de meia área de 96 poços e adicione a mistura principal.
Inicie o leitor de placas e registre o aumento da proporção doador-aceitador a cada 60 a 90 segundos por pelo menos 20 minutos ou até que o aumento do sinal atinja um platô. Exporte os dados e calcule a proporção doador-aceitador dividindo a RFU do doador pela RFU do aceitador para cada ponto de tempo e amostra. Em seguida, calcule a média da razão doador-aceitador e o desvio padrão. Determine a inclinação dentro do crescimento linear da mudança da proporção doador-aceitador.