Um ensaio in vitro para medir a atividade da serina protease de neutrófilos usando um repórter fluorescente

Pegue uma microplaca contendo proteases de serina neutrófila ou NSPs. Essas enzimas solúveis com atividade proteolítica, secretadas por neutrófilos, funcionam nas respostas inflamatórias.

Adicione sondas repórteres fluorescentes carregando um motivo de reconhecimento que atua como um local de clivagem para NSPs. As sondas são conjugadas a um doador e a um fluoróforo aceitador.

Após a excitação por um comprimento de onda específico, o fluoróforo doador emite energia. Devido à sua proximidade com o doador, o fluoróforo aceitador absorve a energia e emite fluorescência de um comprimento de onda diferente.

Detecte os sinais do doador e do aceitador separadamente e calcule a proporção doador-aceitador para avaliar a atividade do NSP. Uma proporção baixa indica extinção da fluorescência do doador na ausência de clivagem da sonda.

Os NSPs reconhecem e clivam o motivo de reconhecimento nas sondas, liberando o aceitador.

A distância do aceptor permite a emissão de fluorescência do fluoróforo doador, aumentando a proporção doador-aceitador. Uma alta proporção indica clivagem eficiente da sonda pelos NSPs.

Descongele as enzimas no gelo e estabeleça uma curva padrão de enzimas, conforme descri