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A uma amostra de sangue total, adicione complexos de anticorpos específicos direcionados contra as células sanguíneas, exceto neutrófilos.
Adicione partículas magnéticas que se ligam às células sanguíneas ligadas ao complexo de anticorpos.
Transfira a amostra marcada imunomagneticamente para a porta de carregamento celular de um chip microfluídico.
Conecte discos magnéticos à porta de carregamento da célula.
O campo magnético atrai as células marcadas imunomagneticamente, prendendo-as nas paredes laterais da porta.
Os neutrófilos, sendo não marcados, fluem para o chip e ficam presos na área de acoplamento celular.
Adicione a solução quimioatraente marcada com fluorescência e o meio de migração aos reservatórios designados. Os líquidos fluem através dos canais microfluídicos, formando um gradiente de concentração.
Quando o quimioatraente se liga ao receptor de neutrófilos, ele desencadeia alterações intracelulares, fazendo com que os neutrófilos reorganizem seu citoesqueleto e estendam os pseudópodes.
Esses pseudópodes agem como pés, impulsionando os neutrófilos em direção a concentrações mais altas de quimioatraente - um processo chamado quimiotaxia.
Use técnicas de microscopia apropriadas para monitorar a migração de neutrófilos em resposta ao gradiente quimioatraente.
Remova a água deionizada do dispositivo e adicione 100 microlitros de solução de fibronectina da saída. Aguarde três minutos para garantir que todos os canais estejam preenchidos com solução de fibronectina. Em seguida, incube o dispositivo em uma placa de Petri coberta por uma hora em temperatura ambiente.
Em seguida, remova a solução de fibronectina do dispositivo e adicione 100 microlitros de meio de migração da saída. Novamente, aguarde três minutos para garantir que todos os canais sejam preenchidos com o meio de migração. Incubar o dispositivo por mais uma hora em temperatura ambiente, antes de usá-lo no experimento de quimiotaxia. Coloque 10 microlitros de sangue total em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 2 microlitros do coquetel de anticorpos em dois microlitros de partículas magnéticas de um kit de isolamento de neutrófilos e misture suavemente o tubo para rotular magneticamente as células marcadas com anticorpos. Incube a mistura de rótulos por cinco minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, conecte dois pequenos discos magnéticos aos dois lados da porta de carregamento da célula do dispositivo. Aspire o meio de todas as portas do dispositivo. Em seguida, pipete lentamente dois microlitros da mistura de sangue marcada no dispositivo microfluídico a partir da porta de carregamento de células. Coloque o dispositivo microfluídico no microscópio com temperatura controlada a 37 graus Celsius. Aguarde alguns minutos até que neutrófilos suficientes estejam presos na área de encaixe celular.
Em seguida, adicione 100 microlitros da solução quimioatraente em meio de migração de 100 microlitros aos reservatórios de entrada designados, usando dois pipetadores. Isso gerará um gradiente quimioatraente por mistura química contínua baseada em fluxo laminar. O quimioatraente pode ser proteínas recombinantes, como FMLP, ou amostras clínicas, como o sobrenadante do escarro de pacientes com DPOC.
Uma vez que o fluxo tenha se estabilizado, adquira imagens de fluorescência do gradiente de dextrano FITC no canal. Em seguida, incube o dispositivo no estágio de microscópio com temperatura controlada ou em uma incubadora de cultura de células convencional por 15 minutos. Após a incubação, crie imagens do canal de gradiente, usando uma objetiva de 10 vezes para registrar as posições finais da célula para análise de dados.