Um ensaio in vitro para estudar a citotoxicidade de células T CD8⁺ pré-ativadas contra células cancerígenas

Pegue duas populações de células T CD8 ⁺: células T CD8 ⁺ efetoras pré-ativadas por meio do envolvimento mediado por anticorpos de células T e receptores co-estimulatórios e células T CD8 ⁺ suprimidas inibidas por células supressoras derivadas de mielóides.

Adicione essas células T a poços revestidos por membrana basal com células cancerígenas que expressam uma proteína fluorescente com restrição nuclear.

Pipetar um substrato fluorogênico de caspase-3 - um corante fluorogênico de ligação ao DNA conjugado a um peptídeo contendo local de reconhecimento de caspase-3.

incubar. Os receptores de células T efetoras se ligam ao complexo peptídico MHC classe I nas células cancerígenas, desencadeando a liberação de grânulos citotóxicos contendo perforinas e granzimas.

As perforinas criam poros da membrana das células cancerígenas, permitindo a entrada da granzima e a ativação da caspase, iniciando a apoptose.

As caspases ativadas clivam adicionalmente o substrato da caspase fluorogênica, liberando o corante que se liga ao DNA e fluoresce.

Sob um microscópio de fluorescência, as células cancerígenas co-cultivadas com células T efetoras exibem fluorescência nuclear dupla, indicando apoptose de