Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:04 min. • July 8th, 2025
Pegue duas populações de células T CD8 +: células T CD8 + efetoras pré-ativadas por meio do envolvimento mediado por anticorpos de células T e receptores co-estimulatórios e células T CD8 + suprimidas inibidas por células supressoras derivadas de mielóides.
Adicione essas células T a poços revestidos por membrana basal com células cancerígenas que expressam uma proteína fluorescente com restrição nuclear.
Pipetar um substrato fluorogênico de caspase-3 - um corante fluorogênico de ligação ao DNA conjugado a um peptídeo contendo local de reconhecimento de caspase-3.
incubar. Os receptores de células T efetoras se ligam ao complexo peptídico MHC classe I nas células cancerígenas, desencadeando a liberação de grânulos citotóxicos contendo perforinas e granzimas.
As perforinas criam poros da membrana das células cancerígenas, permitindo a entrada da granzima e a ativação da caspase, iniciando a apoptose.
As caspases ativadas clivam adicionalmente o substrato da caspase fluorogênica, liberando o corante que se liga ao DNA e fluoresce.
Sob um microscópio de fluorescência, as células cancerígenas co-cultivadas com células T efetoras exibem fluorescência nuclear dupla, indicando apoptose de células cancerígenas.
Em contraste, as células cancerígenas co-cultivadas com células T suprimidas exibem apenas fluorescência de proteína nuclear, sugerindo células não apoptóticas.
Para configurar uma co-cultura de células-alvo de células T CD8-positivas pré-ativadas, primeiro, adicione 30 microlitros de 1 a 100 matrizes de membrana basal solúvel com fator de crescimento diluído reduzido aos poços apropriados de uma placa de fundo plano de 96 poços adequada para microscopia. Agite a placa para espalhar a matriz uniformemente e coloque a placa na incubadora de cultura de células por pelo menos uma hora. Enquanto a placa está se equilibrando, prepare as células-alvo. Aspire o meio, lave com PBS e adicione 1 mililitro de tripsina-EDTA a 0,05% em temperatura ambiente por 1 minuto.
Adicione 9 mililitros de DMEM suplementado com soro fetal bovino por pipetagem suave e transfira as células dissociadas para tubos. Depois de centrifugar as células, ressuspender o pellet em 500 microlitros de EDMEM. Filtre as células ressuspensas através de um filtro de células e conte as células vivas. Em seguida, ajuste a densidade para 4 vezes 10 para as quartas células-alvo por mililitro em EDMEM fresco no gelo.
Em seguida, pipete as células T CD8-positivas pré-ativadas algumas vezes para ressuspender as células em uma suspensão de célula única e transfira as células T flutuantes para um tubo de 1,5 mililitro por condição. Colete todas as células restantes com 200 microlitros de PBS por poço, transfira as lavagens para os tubos apropriados de 1,5 mililitro e centrífugo. Aspirar o meio e adicionar 1 mililitro de EDMEM a cada tubo para centrifugação.
Após a centrifugação, ressuspenda os pellets em 100 microlitros de EDMEM fresco por tubo. Após a contagem, ajuste as células em cada tubo para uma densidade de 1,6 vezes 10 elevado às quintas células T CD8-positivas pré-ativadas por mililitro de meio e coloque as células no gelo. Quando as células estiverem prontas, aspire a matriz da membrana basal de cada poço da placa de microscopia de 96 poços e adicione 50 microlitros de células-alvo a poços individuais dentro dos 60 poços internos da placa com mistura.
Adicione 25 microlitros de EDMEM suplementado com 4 vezes 10 às terceiras unidades por mililitro de IL-2 e 10 substratos micromolares de caspase-3 fluorogênica aos poços apropriados. Em seguida, adicione 25 microlitros de células T CD8-positivas pré-ativadas aos poços apropriados e, finalmente, adicione EDMEM aos poços apropriados para fazer um volume total de até 100 microlitros. Adicione 200 microlitros de PBS ou água estéril em todos os poços vazios, agite a placa e deixe-a em uma superfície plana por 10 minutos.
Para obter imagens das células, configure o microscópio para adquirir imagens em contraste de fase, bem como canais fluorescentes adequados para a proteína fluorescente com restrição nuclear e os fluoróforos de substrato de caspase-3 ativados fluorogênicos usados no experimento. Em seguida, capture imagens de cada poço experimental em contraste de fase e os dois canais fluorescentes a cada uma a três horas por pelo menos 72 horas.