Um ensaio multiplex baseado em esferas para análise de citocinas em amostras de lágrimas humanas

Adicione amostras de lágrimas humanas e um coquetel de esferas de anticorpos em uma placa de ensaio lavada.

Os anticorpos estão ligados a esferas magnéticas codificadas por cores, impregnadas com proporções variadas de fluoróforos correspondentes a assinaturas espectrais distintas, facilitando a detecção de múltiplas citocinas.

As citocinas lacrimais se ligam aos seus anticorpos de captura ligados a esferas correspondentes.

Usando uma arruela de placa magnética, assente os complexos anticorpo-grânulo. Usando tampão, remova as biomoléculas não ligadas.

Adicione anticorpos de detecção biotinilados que se ligam às citocinas ligadas.

Pipeta estreptavidina-conjugado de ficoeritrina, que se liga aos anticorpos biotinilados.

Usando a arruela de placas, remova o conteúdo do poço não ligado. Ressuspenda os complexos ligados a citocinas no fluido da bainha.

Durante a análise da amostra, o sistema fluídico transporta os complexos de esferas para o conjunto óptico.

O primeiro laser ativa os corantes internos do grânulo, com o sinal resultante identificando citocinas específicas.

O segundo laser ativa a molécula repórter ligada ao complexo de grânulos, cuja intensidade de sinal representa a concentração de citocinas, permitindo a quantificação simultânea de múltiplas citocinas.

Para realizar o ensaio multiplex baseado em esferas, leve todos os reagentes à temperatura ambiente e os vortex por cinco a 10 segundos. Se as amostras de lágrimas eluídas foram armazenadas a menos 80 graus Celsius antes do ensaio, descongele os extratos lacrimais congelados no gelo e centrifugue as amostras a 1.000 vezes g por cinco minutos. Prepare uma planilha de ensaio em uma configuração vertical para os padrões de citocinas humanas de trabalho QC-1, QC-2 e amostras.

Adicione 200 microlitros de 1x tampão de lavagem a cada poço da placa e sele-o com um selador de placas. Em seguida, incube a placa em um agitador de placas em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, transvase o tampão de lavagem 1x invertendo a placa e bata-o em toalhas absorventes várias vezes para remover qualquer quantidade residual de tampão de lavagem nos poços.

Em seguida, adicione 25 microlitros de cada citocina humana padrão QC-1, QC-2 e o branco com apenas tampão de ensaio e amostras nos poços apropriados. Adicione 25 microlitros de tampão de ensaio em cada poço. Em seguida, aos poços, adicione 25 microlitros de solução de coquetel de esferas de anticorpo 1x.

Como a solução de cordão de anticorpo é sensível à luz, sele a placa e cubra-a com papel alumínio e tampa da placa para proteger da luz durante o ensaio. Incube a placa a quatro graus Celsius em uma coqueteleira durante a noite. No dia seguinte, coloque a placa no suporte de placas de uma lavadora automática de placas magnéticas e deixe-a descansar por um minuto para assentar as contas magnéticas no fundo do poço.

Aspire o conteúdo do poço e adicione 200 microlitros de tampão de lavagem por poço usando a lavadora automática de placas magnéticas. Deixe a placa descansar por um minuto e, em seguida, aspire o conteúdo do poço como antes e repita a lavagem mais uma vez. Adicione 25 microlitros de solução de anticorpos de detecção em cada poço. Feche a placa, cubra-a com papel alumínio e tampa da placa e incube em temperatura ambiente em uma coqueteleira por 60 minutos. Em seguida, adicione 25 microlitros de solução de estreptavidina-ficoeritrina em cada poço e, após selar e cobrir a placa, incube em temperatura ambiente em um shaker por 30 minutos.

Após a incubação, coloque a placa em uma arruela de placa magnética e deixe descansar por um minuto. Em seguida, aspire o conteúdo do poço e adicione 200 microlitros de tampão de lavagem por poço. Deixe descansar por um minuto e, em seguida, aspire o conteúdo do poço antes de repetir a lavagem novamente. Adicione 150 microlitros de fluido de bainha a cada poço. Em seguida, coloque a placa em um agitador por cinco minutos em temperatura ambiente para ressuspender as esferas de anticorpos antes de prosseguir com a leitura da placa e analisar as concentrações de citocinas.