Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

Para um ensaio de microneutralização, pegue uma placa de vários poços contendo soro humano inativado por calor, diluído em série, com concentrações decrescentes de anticorpos neutralizantes específicos para influenza.

Introduzir vírus influenza patogênicos. Os anticorpos séricos interagem com os vírus e os neutralizam; no entanto, diluições séricas mais altas exibem neutralização viral limitada.

Semente com células do rim canino de Madine-Darby, ou células MDCK, superexpressando resíduos de ácido siálico humano em sua superfície.

Na diluição mais alta, os vírus influenza não neutralizados se fundem com o ácido siálico das células, liberando o genoma viral no citoplasma celular.

Os genes virais são transcritos e traduzidos em proteínas virais e nucleoproteínas dentro da célula hospedeira.

Trate com alta concentração de acetona para fixação e permeabilização.

Introduzir anticorpos primários que interagem com nucleoproteínas virais.

Sobreposição com anticorpos secundários conjugados com enzimas que interagem com anticorpos primários. Lave e trate com o substrato da enzima, produzindo um produto colorido.

Quantifique as intensidades de cor e plote-as em relação à diluição do soro; a maior diluição do soro, atingindo cinquenta por cento de neutralização do vírus, representa o título de neutralização.

No dia 1 do ensaio MN, descongele os soros em banho-maria a 37 graus Celsius e remova imediatamente após o descongelamento. Inativar o soro humano durante 30 minutos num banho-maria a 56 graus Celsius, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, coloque o soro no gelo e adicione o diluente do vírus ao soro para obter uma pré-diluição de 1 a 10.

Para testar com um vírus, adicione 50 microlitros de diluente de vírus às linhas B a H, exceto nas colunas 11 e 12. Em seguida, adicione 100 microlitros de 1 de 10 soros diluídos às colunas A1 a A10. Efectuar uma diluição em série dupla das carreiras A a H e rejeitar os últimos 50 microlitros na carreira H.

Para o controle do vírus, adicione 50 microlitros de diluente de vírus aos poços A12, B12, C12 e D12. Para o controle celular, adicione 100 microlitros de diluente de vírus aos poços E12, F12, G12 e H12. Para os soros de controle, adicione 100 microlitros de soros de controle diluídos ao poço A, coluna 11, e adicione 50 microlitros de diluente de vírus aos poços B11 a H11. Prossiga para diluir em série. Cubra as placas e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, até que esteja pronto para a adição do vírus.

Para adição de vírus, diluir o vírus a 100 TCID50 em 50 microlitros com diluente de vírus. Adicione 50 microlitros de vírus diluído a todos os poços, exceto a coluna 11 nas placas de titulação traseira e os poços de controle de células E12, F12, G12 e H12 em todas as placas. Adicione 50 microlitros de diluente de vírus a todos os poços na coluna 11. Em seguida, adicione 50 microlitros do vírus a 100 TCID50 em 50 microlitros ao primeiro poço.

Em seguida, misture e transfira 50 microlitros para poços sucessivos para realizar diluições seriais duplas. Troque as pontas da pipeta entre os poços para evitar o transporte do vírus. Descarte 50 microlitros do poço H11 e, em seguida, adicione 50 microlitros de diluente de vírus à coluna 11 para trazer o volume final para 100 microlitros. Bata nos pratos para misturar. Incube as placas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por uma hora antes de realizar a adição de células MDCK no primeiro dia e ELISA no segundo dia como antes.

Após adicionar os anticorpos primários e secundários, conforme descrito no protocolo de texto, realize a adição de substrato e a leitura da placa. Lave as placas cinco vezes com 300 microlitros de tampão de lavagem e bata em um pano sem fiapos. Adicione 100 microlitros de substrato OPD recém-preparado a cada poço. Em seguida, incube as placas à temperatura ambiente até que os poços de controle de vírus atinjam uma densidade óptica de 490 nanômetros entre 0,8 e 3, com o controle da célula em um OD de fundo baixo inferior a 0,2. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de parada a todos os poços.

Leia o OD dos poços a 490 nanômetros, usando um espectrofotômetro de microplacas. Por fim, determine o título de anticorpos neutralizantes de cada amostra de soro, conforme descrito no protocolo de texto.