Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:42 min. • July 8th, 2025
Pegue uma microplaca contendo segmentos de bainha uniformes cortados de mudas de arroz e discos de folhas obtidos de folhas de plantas de arroz.
Adicione água estéril e incube durante a noite para permitir a recuperação do estresse da ferida.
Adicione um peptídeo imunogênico derivado de flagelos bacterianos que atua como um padrão molecular associado a patógenos ou PAMP.
As células vegetais nas bordas cortadas se ligam aos PAMPs por meio de receptores de reconhecimento de padrões.
A ligação desencadeia a sinalização a jusante, ativando uma enzima localizada na membrana plasmática denominada homóloga da oxidase respiratória ou RBOH.
O RBOH ativado produz espécies reativas de oxigênio ou ROS no apoplasto - o espaço intercelular. As ROS produzidas são convertidas em peróxido de hidrogênio.
Adicione uma enzima peroxidase e um substrato quimioluminescente.
A peroxidase utiliza peróxido de hidrogênio para converter o substrato em um intermediário de estado excitado, que libera energia como luz e retorna ao estado fundamental.
Meça a luminescência em ambos os tipos de tecido para detectar um aumento acentuado imediatamente após o tratamento com PAMP, indicando uma explosão de ROS.
Corte a bainha de mudas de arroz de 10 dias em segmentos de 3 milímetros com uma lâmina de barbear afiada ou lâmina cirúrgica para pré-tratamento um dia antes do ensaio ROS. Coloque 5 segmentos de bainha em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas.
Corte os discos de folhas de plantas de arroz de quatro a seis semanas usando um punção de biópsia com um êmbolo. Sempre corte os discos foliares do terço médio da segunda folha do leme principal para reduzir a variação dos dados. Em seguida, coloque um disco de folhas em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas para pré-tratamento. Mantenha todos os discos foliares flutuando e voltados para cima nos poços de uma placa de microtitulação para pré-tratamento da água para evitar variações associadas ao lado da folha.
Prepare a solução de elicitação combinando 9,4 ml de tris-HCl 50 micromolar, 400 microlitros de solução L-012, 100 microlitros de peroxidase de rábano e 100 microlitros de flg22. Adicione 200 microlitros de solução de elicitação aos poços.
Inicie o software e clique no botão Experimentos para criar um novo protocolo ou usar um protocolo existente. Clique em Procedimento no pop-up para configurar a placa e selecione os poços da placa a ser monitorada. Clique em Iniciar cinética e defina o tempo de execução como 30 minutos ou mais, dependendo dos requisitos experimentais. Selecione o intervalo mínimo para obter as leituras com a maior frequência possível e, para o tempo de integração, escolha 1 segundo ou mais, dependendo da intensidade do sinal.
Clique em Validar seguido de OK para confirmar as configurações. Em seguida, clique em Detectar uma nova placa no pop-up e aguarde até que o software solicite a caixa de diálogo da placa de carga. Remova cuidadosamente a água bidestilada dos poços contendo os tecidos pré-tratados, evitando qualquer dano tecidual ou dessecação. Use uma pipeta multicanal para adicionar 200 microlitros da solução de elicitação aos poços que contêm os tecidos. Coloque a placa a ser testada no transportador e comece a detecção.