Um ensaio para estudar a fagocitose induzida pelo receptor Fcγ em monocamadas de monócitos

Comece com glóbulos vermelhos ou hemácias.

Adicione anticorpos policlonais específicos para antígenos de superfície de hemácias.

incubar. Os anticorpos opsonizam as hemácias, revestindo-as por meio de ligação específica a antígenos de superfície.

Centrifugue e remova os anticorpos não ligados.

Adicione as hemácias opsonizadas por anticorpos ressuspensas a uma lâmina com várias câmaras contendo monocamadas de monócitos. Incubar.

Os receptores gama Fc de superfície nos monócitos se ligam à região Fc dos anticorpos policlonais ligados às hemácias.

Essa ligação causa agrupamento de receptores Fc ao redor da área de contato e desencadeia a sinalização intracelular, resultando na reorganização do citoesqueleto de actina nos monócitos.

Esse rearranjo do citoesqueleto induz extensões de pseudópodes e cria um copo fagocítico ao redor das hemácias opsonizadas.

O copo fagocítico envolve progressivamente as hemácias opsonizadas, levando ao seu engolfamento completo dentro de um fagossomo ligado à membrana.

Após a incubação, lave a lâmina com tampão para remover as hemácias não fagocitadas. Fixe as células.

Monte o slide usando a mídia de montagem.

Realize microscopia de contraste de fase para visualizar e quantificar as hemácias fagocitadas dentro dos monócitos.

Para opsonizar os glóbulos vermelhos R₂R₂, primeiro, lave os glóbulos vermelhos três vezes em PBS. Diluir o sedimento R₂R₂ após a terceira centrifugação na proporção de um para um com anticorpos anti-D policlonais de soro humano para uma incubação de uma hora a 3 graus Celsius com mistura intermitente. No final da opsonização, remova as células da incubadora e lave-as mais três vezes em PBS, conforme demonstrado.

Ressuspenda o pellet a 1,25% volume a volume em meio RPMI completo. Em seguida, substitua o sobrenadante de cada poço da lâmina de oito câmaras por 400 microlitros das células R₂R₂ opsonizadas por duas horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, use os adaptadores de lâmina para remover as câmaras, enxugando o excesso de R₂R₂ com uma toalha de papel.

Agora, encha um béquer de 100 mililitros com PBS e mergulhe lentamente cada lâmina 30 a 40 vezes na solução salina para remover a maior parte do R₂R₂ não fagocitado. Após a secagem, fixe as lâminas em metanol 100% por 45 segundos e deixe as células secarem antes de montar as amostras com lamínulas.

No dia seguinte, carregue cada lâmina em um microscópio de contraste de fase com uma lente objetiva de 40x e conte manualmente pelo menos 200 monócitos e o número de R₂R₂ fagocitados dentro de cada monócito usando um contador em cada mão para quantificar simultaneamente o número de monócitos e o número de células R₂R₂ fagocitadas por amostra.