JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Comece com uma placa de vários poços contendo fluido de lavagem broncoalveolar de camundongo compreendendo uma população de células imunes corada com um corante de viabilidade fluorescente verde.
Introduzir anticorpos Fc para bloquear os receptores Fc das células imunes.
Adicione um coquetel de anticorpos marcados com fluoróforo distintos direcionados a marcadores celulares específicos. Remova os anticorpos não ligados e ressuspenda as células em um tampão.
Usando citometria de fluxo, identifique singletas de fluorescência fraca, indicando células vivas.
Iluminar células a 488 nanômetros, fazendo com que as células emitam fluorescência vermelha correlacionada com células que expressam CD11c.
Dentro da população de CD11c alto, com filtros de comprimento de onda apropriados, identifique as proteínas marcadoras celulares MHC-II em células dendríticas e SiglecF em macrófagos.
Na população CD11c baixa, a expressão de CD3 em células T e CD19 em células B permite sua identificação.
Ilumina as células a 405 nanômetros, emitindo fluorescência azul, significando os neutrófilos que expressam CD11b.
Células iluminantes a 633 nanômetros excitam fluoróforos vermelhos distantes em eosinófilos que expressam Ly-6G.
Usando dados de citometria de fluxo, enumere a abundância de cada tipo de célula imune no fluido de lavagem broncoalveolar.
Após a terceira coleta de lavagem broncoalveolar, centrifugue o aspirado acumulado e armazene o sobrenadante a 80 graus Celsius negativos. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de lise ACC. Após não mais de dois minutos à temperatura ambiente, diluir o tampão de lise com um mililitro de PBS frio e recolher as células por centrifugação.
Ressuspenda o pellet no volume apropriado de PBS para o número de amostras a serem analisadas e alíquota as células no número apropriado de poços de uma placa de 96 poços para a análise. Colete as células por outra centrifugação e ressuspenda os pellets em 50 microlitros de bloco FC em PBS.
Após 10 minutos em temperatura ambiente, adicione 50 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado de interesse a cada poço e incube as células por 30 minutos a quatro graus Celsius protegidas da luz. Ao final da incubação, centrifugar a placa e descartar o sobrenadante, ressuspendendo os pellets até um volume final de 200 microlitros de tampão FACS por poço para análise por citometria de fluxo.