Um ensaio de resazurina de ágar carvão para avaliar a atividade do composto de teste contra micobactérias

Pegue uma placa de vários poços contendo micobactérias. Adicione concentrações crescentes de compostos de teste aos poços.

incubar. Dependendo da ação do composto sobre as micobactérias, ele pode inibir o crescimento de micobactérias, exibindo uma atividade bacteriostática, ou eliminar as micobactérias, demonstrando atividade bactericida.

Transferir alíquotas de poços para um ensaio de resazurina de ágar carvão, ou CARA, microplaca contendo ágar com carvão ativado para absorver o composto de ensaio, evitando efeitos de transição.

incubar. A atividade bacteriostática do composto inibe a replicação micobacteriana, enquanto a atividade bactericida reduz a viabilidade micobacteriana.

Adicione tampão, resazurina e um surfactante não iônico para dispersar a resazurina nos poços.

Nas micobactérias metabolicamente ativas, as desidrogenases reduzem a resazurina fracamente fluorescente de cor azul a uma resorufina fluorescente rosa.

Usando um leitor de microplacas, meça a fluorescência da resorufina nos poços.

Poços sem fluorescência de resorufina indicam a atividade bactericida do composto.

A intensidade de fluorescência variável entre os poços indica a carga bacteriana viva, refletindo a potência bactericida ou bacteriostática dependente da concentração dos compostos de teste.

Inocular tubos de centrífuga de polipropileno de fundo redondo ou cônicos contendo 4 ou 20 mililitros, respectivamente, de Middlebrook 7H9-ADN ou 7H9-OADC com M. smegmatis a um OD₅₈₀ de 0,01 a 0,1. Incubar as culturas de M. smegmatis a 37 graus Celsius e 20% de O₂ com agitação, expandindo as culturas para a fase mid-log ou uma OD₅₈₀ aproximada de 0,5.

Para configurar um experimento de estilo de concentração inibitória mínima sob condições replicantes e não replicantes, distribua 200 microlitros de células em 7H9-ADN a um OD₅₈₀ de 0,01 em todos os poços de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo transparente.

Para o ensaio não replicante, use PBS contendo 0,02% de tiloxapol para lavar as células duas vezes e use meio não replicante para ressuspender as células. Use meio não replicante para diluir as células até um OD₅₈₀ de 0,1 e adicione nitrito de sódio a uma concentração final de 0,5 a 5 milimolares de um estoque molar de 1 molar recém-preparado.

Distribua 200 microlitros de células a um OD₅₈₀ de 0,1 em todos os poços de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo transparente. Depois de preparar os agentes de teste de acordo com o protocolo de texto, adicione 2 microlitros do agente de teste # 1 nas linhas A a E e 2 microlitros do agente de teste # 2 nas linhas E a H e misture bem.

Para ensaios de replicação, incube microplacas de M. smegmatis a 37 graus Celsius, 20% de O₂ e 5% de CO₂ por 1 a 48 horas. Nos momentos em que o CARA será usado como leitura, use uma pipeta multicanal P200 ajustada em 50 a 75 microlitros para ressuspender cuidadosamente o conteúdo do poço da placa de ensaio estilo MIC90 pipetando para cima e para baixo 5 a 10 vezes. Em seguida, use as pontas da pipeta para girar suavemente o conteúdo dos poços em movimentos circulares.

Transfira 10 microlitros do conteúdo do poço de ensaio não diluído para os poços correspondentes da microplaca CARA, evitando respingos durante as transferências e garantindo que a alíquota de 10 microlitros seja localizada no meio dos poços da microplaca CARA. Com fita adesiva, amarre pilhas de microplacas CARA e, em seguida, coloque-as em um saco plástico que possa ser fechado novamente. Incube as microplacas de M. smegmatis CARA a 37 graus Celsius com 20% de O₂ por um a dois dias para placas replicantes e por dois a três dias para placas não replicantes.

Quando uma película de crescimento bacteriano ou colônias macroscópicas maiores forem visíveis nos poços de controle negativo, use um único conjunto de 12 ponteiras P200 com uma pipeta multicanal para dispensar 40 microlitros de PBS estéril ao longo da lateral dos poços e permita que o PBS se distribua pelo topo das microcolônias bacterianas de ágar.

Prepare o reagente revelador CARA misturando 5 miligramas de resazurina e 50 mililitros de 5% de Tween-80 em PBS. Adicione 50 microlitros de reagente revelador CARA recém-preparado a cada poço da microplaca CARA. Em seguida, balance as placas para frente e para trás algumas vezes para ajudar a distribuir o reagente pelo ágar e pelo tapete bacteriano em cada poço. Coloque as placas em um saco plástico que possa ser fechado novamente e incube a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para M. smegmatis.

Antes de ler a fluorescência, coloque as microplacas CARA em uma capa de biossegurança por 15 minutos em temperatura ambiente com as tampas removidas. Ao usar espectrofotômetros BSL3 fora de um gabinete de biossegurança, cole um adesivo de PCR de qualidade óptica sobre a placa e use uma toalha de papel macia para selar firmemente pressionando suavemente a superfície do adesivo. Determine a fluorescência por leitura superior com excitação a 530 nanômetros e emissão a 590 nanômetros.