Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:08 min. • July 8th, 2025
Pegue tubos contendo macrófagos repórteres com o gene da fosfatase alcalina embrionária secretada ou enzima SEAP sob um promotor induzível.
Em um tubo, introduza um anticorpo específico para o receptor Toll-like 2 ou TLR2 de macrófagos, neutralizando sua atividade.
Em outro, adicione um inibidor para suprimir a sinalização TLR4. Deixe o último tubo sem tratamento.
Pegue uma lâmina com câmara com uma camada adsorvida de padrões moleculares associados a danos ou DAMPs - proteínas liberadas durante a necrose celular.
Adicione macrófagos tratados e não tratados em poços separados e incuba.
TLR2 e TLR4 em macrófagos não tratados ligam-se a DAMPs, ativando os fatores de transcrição fator nuclear-kappa-B, ou NF-κB, e proteína ativadora-1, ou AP-1.
Estes se translocam para o núcleo e se ligam ao promotor SEAP, regulando positivamente a produção de SEAP, que é secretada extracelularmente.
Transferir o sobrenadante contendo SEAP para uma microplaca com um substrato cromogénico.
O SEAP hidrolisa o substrato, produzindo um produto de cor azul-púrpura. Meça a absorbância.
A neutralização de TLR2 reduz fortemente a produção de SEAP, indicando TLR2 como o mediador primário.
Para avaliar os efeitos de uma camada de proteína adsorvida na atividade de NF-kB / AP-1 mediada por receptor toll-like, após o crescimento de macrófagos repórteres em um frasco de tamanho apropriado para 70% de confluência, separe as células com uma solução de dissociação enzimática apropriada, conforme demonstrado.
Ressuspenda as células em uma concentração de 7,3 x10,5 células por mililitro em meio de ensaio e alíquota as células uniformemente entre três tubos. Trate o primeiro tubo de células com um micrograma por mililitro de inibidor de TLR4 por 60 minutos à temperatura ambiente. Trate o segundo tubo com 50 microgramas por mililitro de anticorpo anti-TLR2 por 30 minutos à temperatura ambiente e deixe o terceiro tubo em temperatura ambiente sem tratamento.
Enquanto as células estão incubando, adicione 200 microlitros de lisado e 10% de soro bovino fetal a três poços pegajosos por condição. Deixe as proteínas adsorverem a 37 graus Celsius pelo período experimental apropriado antes de aspirar as soluções de proteína com uma nova pipeta Pasteur para cada poço e lavar as superfícies pegajosas do poço três vezes com 250 microlitros de PBS por poço, por 5 minutos por lavagem.
No final do tratamento com macrófagos repórteres, adicione 200 microlitros de solução celular a cada poço. Adicionar Pam3CSK4 a uma concentração final de 150 nanogramas por mililitro a dois alvéolos como controlo positivo para TLR2, conforme ilustrado no esquema.
Para um controle positivo para TLR4, adicione lipopolissacarídeo a uma concentração final de 1,5 microgramas por mililitro a dois poços. Após 20 horas a 37 graus Celsius, coloque 20 microlitros de sobrenadante de cada poço em duplicata em uma placa de 96 poços, incluindo três poços com 20 microlitros de meio de ensaio por poço como o controle de fundo.
Em seguida, adicione 200 microlitros de reagente de ensaio repórter SEAP a cada poço e cubra a placa com um selo adesivo para uma incubação de 2 horas e meia a 37 graus Celsius. Transfira o restante do sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro por poço pegajoso e sedimente os detritos por centrifugação. Em seguida, transfira os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mililitro para armazenamento de menos 80 graus Celsius para análise de citocinas pró-inflamatórias a jusante por ELISA. No final da incubação, remova o selo adesivo da placa e leia a absorbância em um leitor de placas a 635 nanômetros.