Um ensaio para sinalização do fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em macrófagos

0 visualizações • 4:08 min. • July 8th, 2025

Pegue tubos contendo macrófagos repórteres com o gene da fosfatase alcalina embrionária secretada ou enzima SEAP sob um promotor induzível.

Em um tubo, introduza um anticorpo específico para o receptor Toll-like 2 ou TLR2 de macrófagos, neutralizando sua atividade.

Em outro, adicione um inibidor para suprimir a sinalização TLR4. Deixe o último tubo sem tratamento.

Pegue uma lâmina com câmara com uma camada adsorvida de padrões moleculares associados a danos ou DAMPs - proteínas liberadas durante a necrose celular.

Adicione macrófagos tratados e não tratados em poços separados e incuba.

TLR2 e TLR4 em macrófagos não tratados ligam-se a DAMPs, ativando os fatores de transcrição fator nuclear-kappa-B, ou NF-κB, e proteína ativadora-1, ou AP-1.

Estes se translocam para o núcleo e se ligam ao promotor SEAP, regulando positivamente a produção de SEAP, que é secretada extracelularmente.

Transferir o sobrenadante contendo SEAP para uma microplaca com um substrato cromogénico.

O SEAP hidrolisa o substrato, produzindo um produto de cor azul-púrpura. Meça a absorbância.

A neutralização de TLR2 reduz fortemente a produção de SEAP, indicando TLR2 como o mediador primário.

Para avaliar os efeito

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Receptor do Tipo Toll