JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 5:54 min • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo fibroblastos de camundongo em meios privados de soro. Adicione diluições seriadas de anticorpos específicos para TNFα.
Adicione TNFα - uma citocina inflamatória.
incubar. A privação sérica induz estresse celular, tornando as células suscetíveis à apoptose mediada por TNFα.
A ligação do TNFα a seus receptores nas células privadas de soro desencadeia cascatas de sinalização intracelular, ativando a cascata de caspase e induzindo a apoptose.
No entanto, a ligação do anticorpo ao TNFα impede sua ligação ao receptor, inibindo a ativação da caspase.
Após a incubação, adicione uma mistura de reagentes contendo detergente, um substrato de caspase proluminescente e uma enzima luciferase junto com íons ATP e magnésio. Misture e incuba.
O detergente permeabiliza as membranas, liberando caspases das células induzidas por TNFα.
O substrato bioluminescente contém um sítio de reconhecimento de caspase. Caspases específicas clivam o substrato, gerando aminoluciferina.
A luciferase oxida seu substrato, a aminoluciferina, resultando em emissão de luz.
Meça a intensidade da luminescência para detectar um declínio na luminescência com o aumento das concentrações de anticorpos, indicando a potência dos anticorpos específicos do TNFα para neutralizar o TNFα e prevenir a apoptose induzida pelo TNFα.
Adicione 50 microlitros de suspensão celular aos 60 poços internos da placa de ensaio, começando da coluna 2 até o 11º. Misture a suspensão de células por pipetagem para adicionar alíquotas à microplaca. Imediatamente, transfira 50 microlitros das diluições mapeadas para a placa de ensaio.
Para pistas paralelas, dispense as diluições girando a micropipeta. As diluições mapeadas podem ser dispensadas nos poços na seguinte ordem. Os controles são dispensados nos poços circundantes.
Dilua o TNF-alfa com 500 microlitros de água ultrapura. Misture com misturador de vórtice a 2.200 RPMs. Transfira para um tubo de 15 mL e, finalmente, dilua para 40 nanogramas por mL com meio de cultura de ensaio. Dispense 50 microlitros da solução de indução de apoptose nos 60 poços externos internos. Dispense microlitros da solução de indução de apoptose nos 60 poços de ensaio internos. Por fim, incube por 16 horas.
No quinto dia, reconstitua o substrato com sua solução tampão conforme indicado nas instruções do fabricante. Misture invertendo cinco vezes. Dispense a solução de substrato e adicione 50 microlitros da solução de substrato a cada poço de amostra na placa de ensaio. Além disso, adicione substrato aos controles. Agitar o ensaio num misturador de vórtices a 400 RPM durante três minutos.
Retire a placa de ensaio do misturador e incube à temperatura ambiente. Ligue um espectrofotômetro de leitor de placas. Abra o software Softmax Pro ou qualquer programa equivalente. Carregue a microplaca no espectrofotômetro e ajuste os seguintes parâmetros.
Ative a função de luminescência no tipo de equipamento na função de ponto final. Ajuste a área da plataforma excluindo as colunas 1 e 12. Selecione o tipo de placa para uma microplaca de fundo transparente padrão de 96 poços. Altere o tempo de integração em até 1250 milissegundos. Ajuste o tempo de agitação da microplaca para 10 segundos. Selecione a parede na qual a substância de referência, a substância analítica e a amostra de controle serão colocadas. Comece a ler.