Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:54 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo fibroblastos de camundongo em meios privados de soro. Adicione diluições seriadas de anticorpos específicos para TNFα.
Adicione TNFα - uma citocina inflamatória.
incubar. A privação sérica induz estresse celular, tornando as células suscetíveis à apoptose mediada por TNFα.
A ligação do TNFα a seus receptores nas células privadas de soro desencadeia cascatas de sinalização intracelular, ativando a cascata de caspase e induzindo a apoptose.
No entanto, a ligação do anticorpo ao TNFα impede sua ligação ao receptor, inibindo a ativação da caspase.
Após a incubação, adicione uma mistura de reagentes contendo detergente, um substrato de caspase proluminescente e uma enzima luciferase junto com íons ATP e magnésio. Misture e incuba.
O detergente permeabiliza as membranas, liberando caspases das células induzidas por TNFα.
O substrato bioluminescente contém um sítio de reconhecimento de caspase. Caspases específicas clivam o substrato, gerando aminoluciferina.
A luciferase oxida seu substrato, a aminoluciferina, resultando em emissão de luz.
Meça a intensidade da luminescência para detectar um declínio na luminescência com o aumento das concentraçõe
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