Um ensaio in vitro baseado em células dendríticas pulsadas por vacina para induzir a proliferação de linfócitos

Comece adicionando os antígenos da vacina de teste à cultura de células dendríticas.

A célula dendrítica reconhece o antígeno, internaliza-o por meio de endocitose mediada por receptor, fragmenta-o em peptídeos menores e transfere o complexo antígeno-MHC resultante para a superfície celular para apresentação.

Co-cultura de células dendríticas apresentadoras de antígenos com linfócitos T virgens para permitir a interação entre o receptor de células T e o complexo antígeno-MHC, juntamente com seus co-receptores.

Isso leva à formação de sinapses imunológicas, ativando os linfócitos T por meio da sinalização intracelular.

Os linfócitos T ativados sofrem expansão clonal, gerando linfócitos T efetores.

Adicione moléculas de citocinas de interleucina-2 ou IL-2 à cultura e incuba. A ligação da IL-2 desencadeia a sinalização intracelular, permitindo a proliferação e sobrevivência dos linfócitos.

Pegue um pequeno volume da cultura e centrifugue. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular com células dendríticas apresentadoras de antígenos e transfira-o para o mesmo poço.

A reestimulação com antígeno aumenta a proliferação de linfócitos.

Realize análises posteriores para quantificar marcadores específicos associados à proliferação de linfócitos.

Para gerar MoDCs pulsados por antígeno, adicione 1 microlitro por mililitro de vacina contra o vírus da raiva ou suspensão de RV a 1 mililitro de cultura de MoDC ingênua na placa de 24 poços e incube a placa por 48 horas a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. No sétimo dia, mantenha a placa de 24 poços contendo os MoDCs pulsados por antígeno no gelo por 10 minutos antes de adicionar 1 mililitro de PBS gelado por poço e misturá-lo bem. Transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros.

Lave os poços com 2 mililitros de PBS gelado. Colete as células residuais dentro de cada poço e transfira o conteúdo lavado para seus respectivos tubos. Centrifugar a suspensão celular a 500 g durante 7 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet de células MoDCs pulsado por antígeno em um meio de cultura completo para ajustar a concentração final de 100.000 células por mililitro.

Para a cocultura de linfócitos MoDC, semeie os alvéolos de uma placa estéril de 24 poços com 1 mililitro da suspensão de células linfocitárias virgens e 1 mililitro de suspensão MoDC pulsada ou não pulsada por antígeno no sétimo dia do pulso de antígeno. Após dois dias de incubação, suplementar cada poço com 20 nanogramas por mililitro de interleucina-2 recombinante e continuar a incubação por mais 120 horas.

No dia 14, transfira 1 mililitro da co-cultura para um tubo estéril de 1,5 mililitro e centrifugue o tubo. Em seguida, ressuspenda o pellet celular com 1 mililitro de MoDCs pulsados ou não pulsados de antígeno. Misture bem e transfira as suspensões de células para os poços correspondentes.

Após a coloração da superfície celular dos PBMCs e linfócitos e monócitos virgens, transfira 1 mililitro da suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mililitro usando uma pipeta e centrifugue por 10 minutos a 500 g. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de PBS e transfira-o para um tubo de 15 mililitros. Além disso, colete as células residuais e os tubos correspondentes usando 1 mililitro de PBS. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS ao tubo de 15 mililitros que contém as células e misture por pipetagem.

Depois de centrifugar o tubo durante 7 minutos a 850 g, remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celular com a suspensão residual que resta após a decantação do sobrenadante. Transfira a suspensão da célula para uma placa de 96 poços com fundo em V e sele os poços para evitar derramamento.

Quando a coloração estiver concluída, execute a análise do citômetro de fluxo. A partir da visualização em tempo real, ajuste o limite de fluorescência, incluindo voltagem, ganho e tamanho da célula para eventualmente desenhar portas ao redor da população de células desejada, excluindo quaisquer detritos celulares.