Ressonância plasmônica de superfície localizada para detectar secreções de proteínas de uma única célula

Comece com um chip sensor de vidro com matrizes nanoestruturadas de ouro funcionalizadas com uma monocamada automontada contendo grupos carboxila.

Prenda o chip dentro de um conjunto microfluídico e introduza um ligante, para ativar os grupos carboxila.

Adicione ligantes peptídicos, conjugando com os grupos carboxila ativados por meio de ligantes.

Trate com um tampão contendo composto desativador, desativando locais de ligação não específicos e lave com um tampão.

Concentre uma luz polarizada no chip. Usando um sistema de ressonância plasmônica de superfície localizada, obtenha uma imagem das matrizes - aparecendo como quadrados brilhantes contra um fundo escuro.

No ângulo de ressonância, os elétrons de ouro absorvem a luz. Meça a intensidade da luz refletida no ângulo correspondente, para gerar a resposta do sensor.

Introduza células de hibridoma secretoras de proteínas, que se ligam ao chip e lavam.

As células anexadas secretam proteínas que interagem com os ligantes na matriz próxima.

Essas interações alteram o ângulo e a intensidade da luz refletida, resultando em uma mudança na resposta do sensor, confirmando a atividade secretora das células.

Para limpar e regenerar a ressonância plasmônica de superfície localizada, ou chips LSPR, cinzas de plasma a uma potência de 40 watts em uma mistura de 300 mililitros de 5% de hidrogênio e 95% de argônio por 45 segundos. Funcionalizar a superfície do ouro e as nanoestruturas imediatamente após a incineração por plasma, imergindo o chip em uma solução de tiol etanólico de dois componentes consistindo em uma proporção de 3 para 1 de SPO e SPC. Depois de deixar o chip na solução de tiol durante a noite para formar uma monocamada auto-montada, enxágue-o com etanol e seque com gás nitrogênio.

Carregue o chip LSPR dentro de um suporte microfluídico feito sob medida, colocando o chip em uma peça inferior de alumínio. Em seguida, coloque o chip entre esta peça inferior e uma junta de silicone e uma peça superior de plástico transparente usando quatro parafusos para prender o conjunto.

Para uma aplicação típica de tióis à base de SPC, aplique 300 microlitros de uma mistura de 1 para 1 de EDC 133 milimolar e NHS 33 milimolar em água destilada deionizada para ativar os grupos carboxila do componente tiol SPC. Depois de esperar 10 minutos, enxágue manualmente a superfície com PBS 10 milimolares.

Em seguida, conjugue o grupo carboxila ativado com o ligante de interesse por meio de revestimento por gota de 300 microlitros da solução do ligante. Depois de esperar 1 hora e enxaguar a superfície com PBS 10 milimolares, coloque 300 microlitros de etanolamina 0,1 molar em PBS no chip para minimizar a ligação inespecífica. Após esperar 10 minutos, lave a etanolamina com PBS, contendo 0,005% de Tween 20 ou PBS-T20.

Em seguida, coloque uma peça de quartzo acima do chip para reduzir as flutuações nos dados relacionados a um menisco em mudança. Mantenha o chip úmido com tampão PBS-T20 durante a montagem no microscópio. Conecte a tubulação microfluídica ao conjunto e ao buffer de fluxo até que um estado estacionário seja alcançado. Em seguida, coloque o conjunto da ponta LSPR firmemente no suporte de amostra do estágio aquecido.

A configuração óptica para este método é mostrada aqui. A luz da lâmpada halógena é passada através de um filtro de passagem de 593 nanômetros de comprimento para eliminar comprimentos de onda, que não contribuem para a resposta nanoplasmônica. A luz é então polarizada linearmente e a amostra é iluminada, por meio de uma objetiva de abertura numérica de 40x 1,4 para a excitação das nanoestruturas plasmônicas de ouro. A luz espalhada é coletada pela objetiva e passada por um polarizador cruzado para reduzir o sinal de fundo do substrato de vidro. Um divisor de feixe 50/50 é inserido no caminho da luz coletada para análise espectroscópica e de imagens simultâneas.

Depois de permitir que a montagem e o microscópio se equilibrem por pelo menos duas horas, alinhe o chip usando o joystick para que a matriz central fique alinhada com a fibra óptica para espectroscopia. Após a cultura e peletização das células do hibridoma por centrifugação, colhe-as. Em seguida, teste a viabilidade antes de introduzi-los nos chips LSPR. Em seguida, introduza 50 microlitros da solução celular manualmente nos chips LSPR com uma micropipeta. Finalmente, lave as células restantes em solução com meio fresco sem soro usando um sistema de perfusão microfluídica para preparar os chips LSPR para imagens.