Quantificando a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:33 min. • July 8th, 2025
A autofagia em massa envolve o sequestro de carga autofágica e proteínas citosólicas solúveis, incluindo lactato desidrogenase ou LDH, dentro dos autofagossomos para degradação.
Para avaliar o sequestro de LDH, refletindo a atividade autofágica em massa, tome uma cubeta de eletroporação com células carentes de nutrientes tratadas com inibidores para bloquear a degradação autofágica-lisossômica.
Realize a eletroporação para romper seletivamente a membrana celular e liberar proteínas solúveis.
Misture o disruptado celular com solução de sacarose tamponada para preservar os componentes celulares.
Transferir a solução diluída de ruptura necessária para um tubo contendo tampão. Centrifugar para separar o LDH não sequestrado do LDH sequestrado por autofagossomas.
Transferir a solução disruptiva diluída restante, contendo a fracção celular total de LDH, para outro tubo.
Adicione um tampão contendo surfactante não iônico a ambos os tubos para extrair as frações de LDH sequestradas e totais.
Centrifugue e transfira sobrenadantes contendo LDH para tubos contendo tampão com piruvato e NADH.
O LDH converte o piruvato em lactato com a oxidação do NADH, diminuindo os níveis de NADH correlacionan
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