Quantificando a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos

A autofagia em massa envolve o sequestro de carga autofágica e proteínas citosólicas solúveis, incluindo lactato desidrogenase ou LDH, dentro dos autofagossomos para degradação.

Para avaliar o sequestro de LDH, refletindo a atividade autofágica em massa, tome uma cubeta de eletroporação com células carentes de nutrientes tratadas com inibidores para bloquear a degradação autofágica-lisossômica.

Realize a eletroporação para romper seletivamente a membrana celular e liberar proteínas solúveis.

Misture o disruptado celular com solução de sacarose tamponada para preservar os componentes celulares.

Transferir a solução diluída de ruptura necessária para um tubo contendo tampão. Centrifugar para separar o LDH não sequestrado do LDH sequestrado por autofagossomas.

Transferir a solução disruptiva diluída restante, contendo a fracção celular total de LDH, para outro tubo.

Adicione um tampão contendo surfactante não iônico a ambos os tubos para extrair as frações de LDH sequestradas e totais.

Centrifugue e transfira sobrenadantes contendo LDH para tubos contendo tampão com piruvato e NADH.

O LDH converte o piruvato em lactato com a oxidação do NADH, diminuindo os níveis de NADH correlacionando-se com a concentração de LDH.

Quantificar a LDH nas frações celulares sedimentadas e totais para determinar o sequestro de LDH.

Usando uma pipeta, ressuspenda o pellet celular para obter uma suspensão de célula quase única. Transfira esta suspensão para uma cubeta de eletroporação de 4 milímetros. Coloque a cubeta em um eletroporador de onda de decaimento exponencial e descarregue um único pulso elétrico a 800 volts, 25 microfarads e 400 ohms.

Use uma nova ponta de pipeta para transferir a célula que a interrompe para um tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetro contendo 400 microlitros de solução de sacarose tamponada com fosfato gelado e misture brevemente pipetando. Repita esta ressuspensão, interrupção do eletrodo e processo de mistura para cada amostra. Se estiver realizando o procedimento pela primeira vez, certifique-se de verificar a ruptura eficiente e seletiva do eletrodo da membrana plasmática, conforme descrito no texto.

Para obter frações sedimentadas de LDH, remova 550 microlitros de cada solução diluída com ruptura celular e transfira-a para seu próprio tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo 900 microlitros de tampão de ressuspensão gelado com 0,5% de BSA e 0,01% de Tween-20. Pipete brevemente para misturar. Centrifugue a 18.000 vezes g e 4 graus Celsius por 45 minutos para produzir pellets contendo LDH sedimentado. Usando sucção, aspire bem o sobrenadante para deixar os pellets o mais secos possível.

Armazene as amostras de LDH sedimentadas a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para análise. Para frações totais de LDH, transfira 150 microlitros de cada uma das soluções diluídas interrompidas por células para seu próprio novo tubo. Armazene-os em um freezer de 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para análise.

Descongele as amostras de LDH sedimentadas e totais de LDH no gelo. Depois de descongelado, adicione 300 microlitros de tampão de ressuspensão gelado contendo 1,5% de Triton X-405 ao total de amostras de LDH. Gire as amostras em um rolo em uma câmara fria por 30 minutos. Em seguida, adicione 750 microlitros de tampão de ressuspensão gelada contendo 1% de Triton X-405 às amostras de LDH sedimentadas. Use uma pipeta para ressuspender os pellets até que a solução fique homogênea. Centrifugue todas as amostras a 18.000 vezes g em 4 graus Celsius por cinco minutos para sedimentar detritos celulares não dissolvidos.

Após a conclusão da centrifugação, coloque as amostras no gelo. Determine os níveis de LDH nos sobrenadantes usando um ensaio enzimático clássico, conforme descrito no texto, ou qualquer um dos diversos kits disponíveis comercialmente.