Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:53 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa multipoços com diferentes macrófagos repórteres que abrigam o gene da fosfatase alcalina embrionária secretada, ou SEAP, ou um gene da luciferase secretado sob promotores induzíveis.
Adicione meios contendo diferentes híbridos de nanopartículas peptídeo-ouro misturados com lipopolissacarídeos ou LPS aos poços designados.
O LPS se liga a receptores do tipo toll de macrófagos, ou TLR, desencadeando a internalização no endossomo.
A bomba de prótons endossômica transporta prótons para dentro. A acidificação desencadeia a sinalização TLR, ativando fatores de transcrição.
Esses fatores induzem a expressão dos genes repórteres, produzindo SEAP ou luciferase.
Alternativamente, a internalização do LPS junto com os híbridos faz com que os grupos peptídicos carregados negativamente sequestrem prótons luminais, evitando a acidificação endossômica e inibindo a sinalização TLR.
Colete o meio, centrifugue para separar o sobrenadante e adicione substratos para SEAP e luciferase.
O SEAP converte seu substrato em um produto colorido, enquanto a luciferase catalisa seu substrato para produzir luminescência.
Uma redução nos sinais repórter indica a eficácia dos híbridos na inibição da sinalização TLR.
Centrifugue 20 volumes da solução híbrida peptídeo-GNP em tubos eppendorf de 1,5 mililitro a 18.000 vezes g por 30 minutos. Descarte cuidadosamente os sobrenadantes. Transfira os híbridos para um único tubo novo e lave-os duas vezes com 1 mililitro de PBS. Depois disso, ressuspenda os híbridos lavados em um volume de meio R10. Misturar volumes iguais dos híbridos concentrados e do meio R10 contendo LPS, de modo a que a concentração final dos híbridos e do LPS seja, respectivamente, de 100 nanomolares e 10 nanogramas por mililitro.
Em seguida, remova o meio de cultura da placa de cultura de macrófagos. Adicione 100 microlitros da mistura híbrida-LPS em cada poço com três repetições para cada condição. Inclua um controle negativo e um controle LPS. Incube a 37 graus Celsius por 24 horas e, em seguida, transfira o meio de cada poço para um tubo de centrífuga separado. Centrifugue os tubos a 18.000 vezes g em 4 graus Celsius por 30 minutos. Transfira os sobrenadantes para uma nova placa inferior redonda de 96 poços.
Para iniciar o ensaio repórter nessas amostras, adicione 180 microlitros de solução QUANTI-Blue pré-aquecida a cada poço de uma nova placa de fundo plano de 96 poços e, em seguida, transfira 20 microlitros dos sobrenadantes de cada amostra para esta placa. Incube a 37 graus Celsius por uma a duas horas até que a cor azul escura se desenvolva para uma densidade óptica acima de 1. Depois disso, use um leitor de placas para registrar a absorção em 655 nanômetros. Em seguida, transfira 10 microlitros de sobrenadante fresco de cada amostra para uma placa branca de fundo plano transparente de 96 poços.
Usando um injetor automático, adicione 50 microlitros da solução de luciferase a cada poço e registre imediatamente a luminescência poço por poço. Em seguida, valide o efeito inibitório dos candidatos potenciais e avalie a especificidade do TLR conforme descrito no protocolo de texto.