Um ensaio de formação de foco para quantificar os títulos de vírus nos órgãos de um camundongo infectado

Pegue uma placa multipoços contendo uma monocamada de células de mamíferos.

Inocular os poços com diluições seriadas de homogeneizados de tecidos contendo o vírus Zika, derivados de diferentes órgãos de um camundongo infectado.

Ao entrar nas células por endocitose, o vírus se multiplica e brota para infectar as células vizinhas.

Cubra com uma solução de metilcelulose de alta viscosidade, criando uma barreira física que restringe o movimento do vírus.

A barreira permite apenas a infecção de células vizinhas imediatas, formando focos de células infectadas, e garante que cada foco se origine de uma única partícula de vírus, permitindo uma quantificação precisa.

Fixe as células e permeabilize a membrana. Adicione anticorpos primários que entram nas células e interagem com o antígeno viral.

Introduza um anticorpo secundário conjugado com peroxidase que se liga ao anticorpo primário.

Adicione um substrato cromogênico que é convertido pela peroxidase para criar manchas coloridas, indicando os focos de células infectadas.

Conte os focos para quantificar o título do vírus nos diferentes órgãos do camundongo.

Retirar as amostras homogeneizadas do congelador de 80 graus Celsius negativos e deixá-las descongelar. Com as amostras no gelo, dilua o vírus Zika 10 vezes no primeiro poço da placa de diluição e use uma pipeta multicanal para fazer diluições seriais de 10 vezes na placa, trocando as pontas a cada vez, adicionando 20 microlitros de amostra em 180 microlitros de meio de crescimento.

Trocar as pontas das pipetas entre cada diluição. Prepare a placa formadora de foco removendo a mídia da placa de fundo plano preparada de 96 poços que cobre as células Vero. Para evitar que a monocamada seque, adicione imediatamente 100 microlitros da diluição do vírus a cada poço na placa Vero. Use o mesmo conjunto de pontas para adicionar da concentração mais baixa à mais alta.

Placas de rocha lado a lado 2 a 4 vezes e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas. Aqueça 2% de metilcelulose à temperatura ambiente. Em seguida, diluir a solução de metilcelulose a 2% em meio de cultura na proporção de aproximadamente 2 para 1. Após a incubação, adicione 125 microlitros do meio de crescimento de metilcelulose a cada poço das placas de 96 poços. Incube novamente a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 32 a 40 horas.

Para fixar as células Vero, em um gabinete de biossegurança, adicione 50 microlitros de paraformaldeído a 5% por cima da camada de metilcelulose em cada poço das placas de 96 poços. Incube por 60 minutos em temperatura ambiente. Como alternativa, cubra as placas com parafilme e coloque-as a 4 graus Celsius durante a noite.

Depois disso, use uma pipeta para remover a cobertura e a mídia das células em um recipiente descartável dentro do gabinete de biossegurança. Lave suavemente com 150 microlitros de PBS por poço. Remova o PBS das placas e remova a placa do gabinete de biossegurança. Repita a lavagem PBS duas vezes. Em seguida, adicione 150 microlitros por poço uma vez o tampão de lavagem FFA e deixe em temperatura ambiente por 5 a 10 minutos para permeabilizar as células fixas.

Em seguida, use o anticorpo primário contra o zika para detectar a infecção. Preparar o anticorpo primário 4G2 a uma concentração de 1 micrograma por mililitro em tampão de coloração FFA. Sacuda o tampão de lavagem FFA das placas e adicione 50 microlitros do anticorpo primário no tampão de coloração FFA a cada poço. Em seguida, sele as placas com parafilme ou filme plástico e incube durante a noite a 4 graus Celsius.

Prepare o anticorpo secundário anticorpo anti-camundongo marcado com HRP de cabra em uma concentração de 1 a 5.000 em tampão de coloração FFA. Depois de remover a solução de anticorpos, lave as células três vezes com 150 microlitros de tampão de lavagem FFA por poço. Remova o tampão de lavagem mexendo na pia todas as vezes.

Pinte as células com o anticorpo secundário em tampão de coloração FFA a 50 microlitros por poço e incube de uma a duas horas em temperatura ambiente. Depois disso, lave as células três vezes com tampão de lavagem FFA novamente, removendo o tampão de lavagem sacudindo na pia a cada vez.

Adicione 50 microlitros do substrato Trueblue em cada poço. Aguarde de 2 a 15 minutos até que as manchas estejam totalmente definidas com o mínimo de fundo. Depois que as manchas estiverem visíveis, lave suavemente com água usando a mão para proteger a monocamada da força da água corrente. Seque em papel toalha.

Logo depois, use um escopo de dissecação para contar manualmente os pontos em cada poço ou use um contador de pontos automatizado. No software de imunocaptura, selecione uma diluição com focos facilmente distinguíveis entre 20 a 200 por poço para cada amostra e calcule o título em unidades formadoras de foco por mililitro usando a média de poços duplicados.