Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
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Comece com uma placa de vários poços contendo plasma rico em plaquetas. As plaquetas expressam complexos mecanorreceptores de superfície - responsivos a estímulos mecânicos.
O complexo mecanorreceptor contém o domínio de ligação ao ligante extracelular e a região do macroglicopeptídeo ligada ao domínio mecanosensorial.
Introduzir anticorpos anti-mecanorreceptores, reticulando com os domínios de ligação ao ligante dos receptores em plaquetas opostas.
Coloque uma gota da suspensão plasmática tratada com anticorpos entre os conjuntos do viscosímetro.
Aplique tensão de cisalhamento, simulando força mecânica, afastando os receptores ligados a anticorpos das plaquetas, levando à dissociação da região macroglicopeptídica do domínio mecanosensorial.
Isso desencadeia uma mudança conformacional no domínio mecanosensorial, ativando plaquetas e resultando na expressão de marcadores de superfície.
Transfira a suspensão de plaquetas cisalhada para um novo poço dentro da placa de vários poços.
Introduza um coquetel de moléculas específicas de marcadores marcados com fluoróforo interagindo com os marcadores de superfície plaquetária correspondentes e fixe as células com uma solução fixadora.
Na citometria de fluxo, sinais de fluorescência distintos se correlacionam com os efeitos da tensão de cisalhamento nas plaquetas tratadas com anticorpos.
Para o tratamento com ligantes, lentamente, adicione o anticorpo ou ligante de interesse ao plasma rico em plaquetas e misture as plaquetas suavemente. Durante a incubação, ligue o viscosímetro da placa cônica e ajuste a temperatura da placa para 22 graus Celsius. Após 5 a 10 minutos, transfira o plasma rico em plaquetas tratado para o viscosímetro da placa cônica com temperatura controlada diretamente no centro da placa, tomando cuidado para que toda a amostra seja depositada entre o cone e a placa no ponto de contato.
Para aplicar cisalhamento à amostra, calcule o cisalhamento de acordo com o manual do viscosímetro e aplique o cisalhamento à amostra na taxa e duração apropriadas. No final da aplicação, levante o cone cerca de 2 milímetros da placa, de modo que a amostra permaneça em contato com a placa e o cone, e use uma ponta de pipeta de carregamento de gel para coletar 5 a 10 microlitros do centro do volume da amostra. Em seguida, incubar a amostra cisalhada com anticorpos contra os marcadores de superfície de interesse por 20 minutos à temperatura ambiente e fixar as amostras em paraformaldeído a 2% por 20 minutos em temperatura ambiente.
Para analisar as amostras por citometria de fluxo, colete pelo menos 20.000 eventos para cada condição e quantifique a intensidade do sinal de cada marcador fluorescente usando o valor da altura para a intensidade de cada fluoróforo. Em seguida, utilizar um controlo negativo com albumina de soro bovino ou veículo para desenhar uma porta excluindo os eventos fluorescentes de fundo negativos e quantificar a percentagem de acontecimentos no interior da porta para todas as condições experimentais.