JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 2:49 min • July 8th, 2025
Pegue a suspensão fecal de camundongo compreendendo bactérias do ácido lático, ou LAB, que produzem bacteriocina, um peptídeo antimicrobiano, e inocule em um meio de ágar macio seletivo LAB pré-aquecido.
Despeje o meio em um prato de ágar, formando a primeira camada.
Sobreponha uma segunda camada de ágar e incuba.
A primeira camada promove seletivamente o crescimento de LAB, permitindo que as moléculas de bacteriocina secretadas se difundam para fora das colônias para o meio circundante.
A segunda camada contém um meio livre de células que permite a difusão da bacteriocina e evita o crescimento de colônias de LAB na superfície.
Agora, despeje uma terceira camada de ágar contendo uma cepa sensível à bacteriocina.
As bactérias que crescem na terceira camada encontram a bacteriocina se difundindo das camadas inferiores.
A bacteriocina rompe a membrana celular de bactérias sensíveis, perturbando a homeostase celular e resultando na morte celular, visível como uma zona clara na terceira camada.
Meça o diâmetro da zona para avaliar a potência da bacteriocina.
Para contar as células bacterianas produtoras de bacteriocina em amostras fecais, transfira as células diluídas do produtor de bacteriocina para 4 mililitros de ágar macio MRS pré-aquecido. Misture o ágar por vórtice e despeje as células em uma placa de ágar MRS 1,5%. Essa camada é chamada de primeira camada.
Transfira mais 4 mililitros de ágar mole MRS 0,8% livre de células para a primeira camada para incorporar todas as células dentro do ágar mole. Essa camada destina-se a impedir que as células cresçam como colônias na superfície das placas de ágar.
No capô estéril, seque as placas retirando a tampa por cinco a 10 minutos antes de incubar as placas a 30 graus Celsius por 20 a 24 horas para crescimento celular e formação de colônias.
Para identificar colônias produtoras de bacteriocina, misture 40 microlitros de uma cultura noturna de uma cepa indicadora apropriada com 4 mililitros de ágar mole pré-aquecido para cada placa. Despeje a mistura nos pratos. Essa camada é chamada de terceira camada.
Seque e incube as placas como antes, para crescimento celular e formação de colônias. As colônias produtoras de bacteriocina têm zonas claras de inibição ao redor das colônias.